超声辅助提取新疆甘草总黄酮工艺研究

李金芳，张书源，崔 洁，陈晴晴

（新疆第二医学院，新疆 克拉玛依 834000）

引言

甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhizauralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza Inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza Glabra L.）的干燥根和根茎。甘草是多年生草本植物[1]，其干燥的根及根茎，具有祛痰止咳、补脾益气、缓急止痛、清热解毒之功效，常用于痈肿疮毒、脾胃虚弱、咳嗽痰多，还可用于缓解其他药物的毒性、抑制胃酸的分泌，预防胃肠道溃疡[2-3]。甘草总黄酮可以抑制酪氨酸酶的活性从而起到抗氧化的作用，进而对抗衰老有不错的疗效，如今已被开发利用为绿色、高效的美容化妆产品中的添加剂[4]。

甘草品种较多，全世界共有29 个种以及6 个变种，其中18 个种和3 变种在我国有分布。甘草在新疆有丰富的资源，具有较高的药用价值，目前已从甘草中分离出的化合物多达300 种[5]。《中华人民共和国药典》（2020 年版）收录的有：胀果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat）和光果甘草（Glyeyrrhiza glabra）两种[1，6]。本实验以超声辅助提取法，研究了单因素实验，同时设计正交实验，探索了提取新疆甘草黄酮的最优条件，为新疆甘草黄酮的开发及应用提供一定参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

紫外可见分光光度计，UV1802G，天津冠泽科技有限公司；旋转蒸发仪，N-1300，上海爱朗仪器有限公司；油浴锅，OSB-2200，上海爱朗仪器有限公；万分之一电子天平，LE204E，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；百分之一电子天平，YP202N，上海菁海仪器有限公司；循环水式多用真空泵，SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司；中草药粉碎机，FW135，天津市泰斯特仪器有限公司；数控超声波清洗器，KQ-700DE，昆山市超声仪器有限公司；尼龙筛，40目（0.4 mm）。

1.2 试剂

甘草，批号：911051，新疆本草堂药业有限公司；芦丁，纯度：HPLC≥98%，批号：1009H022，北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠，AR，批号：20200320，天津市盛奥化学试剂有限公司；硝酸铝，AR，天津市盛奥化学试剂有限公司；亚硝酸钠，AR，天津市盛奥化学试剂有限公司；无水乙醇，AR，天津永晟精细化工有限公司。

2 方法与结果

2.1 芦丁对照品溶液制备

精密称取芦丁对照品20 g/mg（120 ℃下干燥至恒重），置于100 mL 的容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，摇匀，备用（质量浓度为0.200 0 mg/mL）。

2.2 芦丁标准曲线的绘制

依次精密移取上述芦丁对照品溶液0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL 置25 mL 量瓶中，依次进行以下操作：

1）加入5%NaNO2溶液2.00 mL，摇匀，静置6 min；

2）加入10% Al（NO3）3溶液2.00 mL，摇匀，静置6 min；

3）再加入4%NaOH 溶液12.00 mL，蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min；

4）紫外可见分光光度法，在522 nm 波长处测定上述各溶液的吸光度值。

以系列芦丁对照品溶液质量浓度（ρ）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为y=11.075x-0.005（r=0.999 6），说明芦丁对照品溶液质量浓度在0.008 mg/mL～0.080 mg/mL 范围内线性关系良好（图1）。

图1 系列质量浓度芦丁对照品溶液标准曲线

2.3 甘草总黄酮提取率计算

甘草总黄酮提取率计算公式见式（1）：

式中：W 为甘草总黄酮提取率，%；C 为甘草总黄酮提取液质量浓度，mg/mL；V 为甘草总黄酮提取液体积，mL；M 为甘草粉末质量，g。

2.4 超声辅助提取甘草总黄酮工艺研究

2.4.1 单因素实验

本实验主要考察料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度、提取功率对新疆甘草总黄酮提取效率的影响。

1）料液比的选择。以不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 的比例进行提取，其他条件保持不变，测定甘草黄酮的提取率。

2）提取温度的选择。以不同提取温度40、50、60、70、80 ℃分别进行提取，其他条件保持不变，测定甘草黄酮的提取率。

3）乙醇浓度的选择。以不同乙醇体积分数90%、80%、70%、60%、50%进行提取，其他条件保持不变，测定甘草黄酮的提取率。

4）提取超声功率的选择。以不同提取超声功率420、490、560、630、700 W 进行提取，其他条件保持不变，测定甘草黄酮的提取率。

5）提取时间的选择。以不同提取时间5、10、15、25、30 min 分别进行提取，其他条件保持不变，测定甘草黄酮的提取率。

通过紫外可见分光光度法测定吸光度，以甘草总黄酮提取率为指标，筛选出对提取率影响最显著的因素（图2）。

图2 提取时间对甘草总黄酮提取率的影响

由图2 可知：随着提取时间的延长，提取率先上升再下降又上升，在10 min 和15 min 时甘草总黄酮的提取率较高，10 min 时的提取率略高于15 min，综合提取率与节能考虑，故选取最佳提取时间为10 min。

由图3 可知，随着料液比的增大，甘草总黄酮的提取率逐渐升高，在料液比为1∶15 和1∶20 时均有较高的提取率，在料液比大于1∶20 后，黄酮的提取率下降，综合各方面因素，选择最佳料液比为1∶15。

图3 料液比对甘草总黄酮提取率的影响

由图4 可知，甘草总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大先升高后降低，当乙醇体积分数为70%时甘草总黄酮提取率最高，当乙醇体积分数大于70%时，甘草黄酮提取率开始下降，因此，选择最佳乙醇体积分数确定为70%。

图4 乙醇体积分数对甘草总黄酮提取率的影响

由图5 可知，随着提取温度的升高，甘草黄酮的提取率先下降再升高，提取达到70 ℃以后提取率基本保持恒定，因此，选择最佳的提取温度为70 ℃。

图5 提取温度对甘草总黄酮提取率的影响

由图6 可知，随超声功率的增加，甘草总黄酮的提取率先减小再增大，当超声功率为630 W 时提取率最高，大于650 W 时，甘草黄酮的提取率开始下降，因此，选择最佳超声功率为630 W。

图6 超声功率对甘草总黄酮提取率的影响

2.4.2 正交实验

从上述单因素实验结果可以看出，超声功率对甘草总黄酮的提取率影响较小，因此，选择提取时间、料液比、提取温度、乙醇浓度4 个因素，设计成L（34）正交实验（表1、表2）。

表1 水平因素设计表

表2 正交实验结果

由表2 可知，从正交实验结果的K 值与R 值可以看出，对新疆甘草总黄酮提取率影响因素的大小顺序为：乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。通过各因素的极差R 值的比较，可以看出，乙醇体积分数和提取温度的极差较大，这说明乙醇体积分数和提取温度对甘草黄酮提取率的影响比较显著；料液比和提取时间的极差较小，说明两个因素对甘草黄酮提取率的影响较小。

通过综合分析单因素实验结果及正交实验结果，确定了新疆甘草总黄酮最佳提取工艺为：乙醇体积分数为80%，料液比为1∶20，提取温度为80 ℃，提取时间为10 min，在此条件下进行验证实验，新疆甘草总黄酮平均提取率为2.27%。

3 结论

本试验采用NaNO3-Al（NO3）3-NaOH 分光光度法，在波长522 nm 处测定新疆甘草中黄酮的含量，该方法操作简单，灵敏度和准确度较高，且线性关系良好。通过单因素实验，确定正交实验的因素和条件，再通过平行实验，测定新疆甘草中总黄酮含量，并计算总黄酮的提取率，获得最优提取工艺条件为：乙醇体积分数为80%，料液比为1∶20，提取温度为80 ℃，提取时间为10 min。此方法的建立为新疆甘草的综合利用提供一定依据，也为更好开发和利用新疆甘草资源提供参考。