新型PI3K 抑制剂HYY 化合物的合成及抗肿瘤活性研究★

梁 青，李伟林，郑学良，马 耀

（山西省化工研究所（有限公司），山西 太原 030021）

引言

磷脂酰肌醇3-激酶（简称为PI3K）抑制剂由于参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能调节而成为小分子肿瘤靶向治疗的明星靶点[1-3]，当前已有4 个PI3K 类小分子靶向新药FDA 批准上市，数十种进入临床阶段的PI3K 类小分子靶向新药[4-6]。

由于氟原子的电负性强并且氟原子半径与氢原子半径接近，因此将其作为基团引入到分子中只是对药物分子结构进行了些微调整，从而改变了药物代谢的途径和速度，延长药物作用时间，提高生物选择性[7-8]。在药物化学中，氟代是最常用，最有效的一种结构修饰方法[9]。

本文以PI3K 类小分子靶向抑制剂IC-87114 为先导化合物，通过现有的药物筛选平台，以氟取代氢，经电化学一步反应合成IC-87114 的氟代化合物，名为HYY 系列化合物，并对其体外的抗肿瘤活性进行研究，旨在发现活性更好的目标化合物，为今后开展临床研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AM-600 型核磁共振波谱仪，NMR，TMS 为内标，DMSO 为溶剂，瑞士Bruker 公司；Micro API 液相质谱联用仪，美国Waters 公司；PrimoVert iLED 荧光级倒置显微镜，德国Zeiss 公司；Puri-Master 2000 全自动制备色谱仪，上海科哲生化科技有限公司；FD-1C-80 型超低温真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；3111 型水套式CO2培养箱，美国Thermo 公司；Multiskan FC 型酶标仪，美国Thermo 公司。

IC87114，购自上海SELLECK 公司；人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MDA-MB-468、人结肠癌细胞SW620、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人肝癌细胞Hep-G2、人非小细胞肺癌细胞A549 和人宫颈癌细胞Hela，均购自上海细胞库；胎牛血清（FBS），购自美国Gibco 公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 HYY 系列化合物的制备

本实验以IC-87114 为原料、乙腈（ACN）/乙二醇二甲醚（DME）/聚乙二醇（PEG）为溶剂，通过自有的药物筛选平台，采用电化学反应一步加氟法合成HYY 系列化合物HYY001 和HYY002（主产物），合成路线如图1 所示。将5 mg IC87114 加入到10 mL 含电解质的ACN/DME/PEG 溶液，超声溶解，将该溶液转移至聚四氟乙烯电解槽，采用Ni/Pt 作电极，通电反应一段时间，LC-MS 监测反应进程。

图1 HYY 系列化合物的合成路线

1.2.2 体外肿瘤活细胞生长抑制研究

CCK-8 法常用于测定药物对细胞增殖及抑制的影响[10-11]。本实验采用CCK-8 法测定HYY 系列化合物对多种细胞株（HT-29、SW620、MDA-MB-468、SK-OV-3 Hep-G2、A549 和Hela）的抗肿瘤活性情况，设置IC87114 为对照组，为进一步发现抗肿瘤活性较好的目标化合物提供参考依据。实验所用细胞株均接种于含有10%胎牛血清的培养基中，且在37 ℃、5%CO2的水套式二氧化碳细胞培养箱中培养至细胞对数生长期的细胞。

将待测化合物以DMSO 助溶后，使用培养基配成初始浓度为100 μmol/L 并以此3 倍递减至终浓度为0.003 μmol/L 的工作液，存放于4 ℃冰箱保存，供测试受试化合物进行所选细胞株增殖抑制实验使用。

取对数期细胞经胰酶消化后，通过细胞计数器计算细胞悬液浓度，随后调整细胞悬液浓度为5×104cell/mL，接种于96 孔板，每孔加入100μL；置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h，加入配好的待测化合物梯度溶液，继续培养72 h；弃液，加入10%CCK-8的培养基溶液，继续培养2 h～4 h。选择450 nm 波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值。以浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，通过软件计算IC50 值，以IC50 值表示药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力。

2 实验结果

2.1 合成工艺优化

本文以溶剂、电极、电解质和电流为四因素，选取不同水平，以主产物HYY002 产率（原料产物比）为考察指标，采用正交实验方法，优化HYY 系列化合物的合成工艺，因素-水平和正交实验结果见表1、表2。

表1 因素水平表

表2 正交实验结果

由表2 正交实验分析结果可知，各反应条件对产率影响因素大小分别为：电解质＞溶剂＞电极≈电流。正交实验指标为主产物HYY002 的产率s/p（原料产物比，LC-MS 计算），指标s/p 值越低产率越高，即指标值越低越好，因此选择每个因素的最小值K1、K2、K3对应水平。由于A 因素列K2＜K1＜K3，B 因素列K2＜K3＜K1，C 因素列K1＜K3＜K2，D 因素列K3＜K2＜K1，所以本实验的最佳工艺条件为A2B2C1D3，即，DME 作溶剂，Et4NF.4HF 作电解质，Ni 作电极，0.03A电流为本实验的最佳工艺条件。按最佳工艺条件进行实验得出的产率s/p 为5.1，且重复实验产率基本一致，说明最佳工艺具有可重现性。

反应结束后将反应液经液相制备仪纯化后通过超低温真空冷冻干燥机冻干后得到白色粉末，产率约为10%。

2.2 目标化合物结构表征

HYY001：1H NMR δ 8.05（s,1H），7.78（s,2H），7.62（s，1H），7.48（d，J=22.8 Hz，4H），7.28（dd，J=44.8，6.0 Hz，2H），5.05（d，J=17.3 Hz，1H），4.69（d，J=17.0 Hz，1H），2.73（s，3H），2.16（s，3H);LC-MS，m/z:[M+H]+416。

HYY002：1H NMR δ 8.06（d，J=10.9 Hz，2H），7.62（t，J=7.7 Hz，1H），7.55（s，1H），7.39（d，J=8.9 Hz，1H），7.34-7.27（m，2H），7.24（m，3H），5.10（d，J=17.3 Hz，1H），4.81（d，J=17.3 Hz，1H），2.73（s，3H），2.16（s，3H）;LC-MS，m/z:[M+H]+416。

2.3 肿瘤细胞生长抑制实验

表3 为HYY 系列化合物对多种癌细胞的抗肿瘤活性测试结果。如表3 所示，HYY001 和HYY002 都有一定的抗肿瘤活性。HYY001 和HYY002 对HepG2、SW620、MDA-MB-468、HT-29 细胞的抑制效果都明显优于IC87114 对照组；其中抑制效果更为突出的是HYY002，其对HT-29、SW620 和MDA-MB-468细胞的抑制活性优于HYY001，IC50 值分别为52.1μM，43.7 μM和78.3 μM；HYY002 对HepG2 细胞的抑制效果与HYY001 相近，均优于IC87114 对照组。初步证实，HYY 系列化合物HYY001 和HYY002 均能明显抑制多种癌细胞增殖且整体抑制效果较IC87114明显，其中HYY002 抑制效果更为明显，可作为目标化合物开展深入研究。

表3 HYY 系列化合物对多种肿瘤细胞增殖抑制活性评价

3 结论

为了给PI3K 类抗肿瘤药物提供新的目标化合物，本研究采用电化学手段一步加氟反应，将IC87114 结构中氢替换成氟，得到2 种取代位置不同的HYY 系列含氟化合物。通过四因素三水平L934 正交实验研究了HYY 系列化合物的最佳工艺为DME溶剂，Et4NF.4HF 电解质，Ni 电极，0.03A 电流。通过药物对肿瘤细胞的抑制活性评价，合成的HYY 系列化合物均具有明显的抗肿瘤活性，且HYY002 抑制效果整体较IC87114 和HYY001 更为明显。但本文设计的合成工艺在最佳条件下产率仍较低，可通过更换电解质的方法更好地提高化合物HYY002 产率。今后将在提高HYY002 产率的基础上，将其作为目标化合物，继续研究评估动物体内药效和毒性等相关特性。