少弱精症患者精浆中IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α水平与氧化应激的关系

王洪艳，曲 莉，李 环

(北华大学公共卫生学院，吉林 吉林 132013)

不孕症是世界上最严重的医学问题之一。男性因素占所有不孕症病例的40%～50%，全世界大约7%的男性受到不孕症的影响[1]。少弱精子症主要以精子浓度降低、精子活力低下为主要表现，是临床常见的男性不育症之一。研究表明，氧化应激是男性不育的一个主要的原因[2]。精液中正常量的活性氧(ROS)在精子获能、激活、顶体反应和精卵融合中发挥重要作用。然而，ROS水平的升高会破坏抗氧化防御，氧化应激诱导的膜完整性丧失、细胞通透性增加、酶失活、DNA结构损伤和细胞死亡可能与精子数量和活力下降有关[3]。细胞脂质的氧化损伤反过来会触发炎症过程的级联信号，促进脂质过氧化，导致细胞内氧化负荷。另外，在男性精液中细胞因子可通过介导炎症反应对男性生殖产生影响[4]，精子功能下降与促炎细胞因子水平升高之间存在相关性[5]。基于以上理论，本研究通过收集正常男性和单纯弱精症、少弱精子症患者精液标本，比较分析不同精浆中细胞因子白介素4(interleukin-4，IL-4)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和氧化应激指标超氧化物歧化酶(activity of superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平，评估氧化应激和细胞因子在男性不育中的关系，为临床男性不育的机制研究提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象来自北华大学附属医院生殖中心就诊的男性患者74例，根据精子质量分为3组：A组为单纯少精子组(精子数小于20×106/mL)26名，B组为单纯弱精子组(精子运动率小于40%)24名，C组为少弱精子组(两者均满足)24名。另外在本医院体检中心的已育人群选取精液质量正常52例男性作为对照组D组。本研究得到北华大学医学伦理委员会的批准，参与的研究对象均签署知情同意书。

病例纳入标准：夫妻未采取避孕措施且有正常性生活1年以上未育(排除女性原因不孕)；排除标准：患有已明确与生育有关的疾病史、泌尿生殖道炎症、相关遗传病史、性功能障碍和吸烟习惯、酗酒和任何慢性疾病史，如糖尿病、冠状动脉疾病或恶性肿瘤等疾病。

1.2 精液制备和分析

患者禁欲3～7 d[6]后通过自慰法获得精液样本，用无菌塑料样本杯中现场收集，按照WHO标准[7]分析精液体积、精子数、精子前向运动率。室温下待精液完全液化后使用WLJY-9000型计算机(CASA，北京伟力新世纪科技发展有限公司)辅助精液分析仪评估精子质量，分析完成后将精液以6000 r/min离心10 min，取上清液置于-75 ℃保存用于生化分析。

1.3 细胞因子及氧化应激标志物检测

采用ELISA定量试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)检测精浆中IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α的水平。SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测精浆中SOD活力、MDA浓度。实验步骤均参照相应试剂盒说明书。

1.4 统计学分析

数据分析使用SPSS19.0进行。结果以平均值±标准差表示。单因素方差分析比较不同组之间氧化应激指标和细胞因子，SNK-q法进一步两两比较，Spearman分析细胞因子浓度与氧化应激指标MDA水平变化的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象年龄和精液质量的测定结果

各组的平均年龄无显著差异，各组精液体积和pH值无统计学差异，但精子总数和精子活力明显低于正常组，以少弱精症患者最为明显(表1)。

2.2 精液细胞因子和氧化应激标志物的检测

少弱精患者精液中细胞因子IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α和MDA水平及SOD活力的测定结果见表2。由表中可见，不育症精浆中IL-6、IL-8、TNF-α浓度均高于正常生育组，差异有显著性(P<0.05)，其中IL-6及TNF-α在少弱精子症C组中表达最高，不同组精浆氧化应激产物MDA浓度变化与IL-6、IL-8、TNF-α浓度变化相同，均表现为严重少弱精子症组最高，与正常生育组相比差异有显著性(P<0.05)。但不育症患者细胞因子IL-4的浓度低于正常生育组，差异有显著性(P<0.05)，不育患者精浆中抗氧化酶SOD的活力较正常生育组降低,差异显著(P<0.05)。

表 1 研究对象年龄和精液质量的测定结果

表 2 精液细胞因子和氧化应激标志物的测定结果

2.3 精浆MDA含量与TNF-α、IL-10、IL-18的相关性

经相关分析,精浆MDA含量与IL-6(r=0.51)、IL-8(r=0.51)和TNF-α(r=0.67)呈正相关,与IL-4呈负相关(r=-0.54)。

3 讨 论

男性精浆作为精子的天然培养基,决定着精子的质量，因此精液分析可以作为评估男性生育潜力的关键。因为精液质量(包括体积、形态和活力)随年龄增长而降低[8]，为消除年龄对生育的影响，本次研究对象间年龄无统计学差异。

精子质膜中多不饱和脂肪酸含量高，极易发生脂质过氧化(lipid peroxidation，LPO)。LPO产生脂质过氧化物，在精子中积累，产生各种衰变终产物，如4-羟基壬烯醛、异前列烷和MDA，可作为氧化应激的指标[9]。测定MDA是检测LPO最常用的方法。人类精浆被认为是抗氧化剂的重要来源。SOD被认为是抗氧化防御系统的第一个酶系。SOD在人类精液中大量表达，其在精液中的含量约为血液中的20倍[10]；动物模型已经发现精液质量与精浆SOD活性密切相关[11]。但其在不同生育质量的精浆中中的活性报道不同，Zelen等[12]报道少精子症、缺精子症和畸形精子症患者精浆中SOD和过氧化氢酶活性明显低于生育对照组，而MDA水平高于不育组。本次调查检测的结果与此相同。本研究发现，MDA水平在正常生育组中较低，而在少、弱精症增高，特别在少弱精子症组异常增高，也进一步证实过氧化损伤与男性生殖力下降密切相关。但Abdallah等[13]报道，与正常精子相比，在无精子、低弱精子和弱精子的男性中SOD活性升高，这一结论假设SOD表达上调是对精子发生缺陷或激素缺乏的反应。各研究之间的差异可能是由于不同的研究方案，以及影响抗氧化酶表达和活性的许多因素的共同结果。鉴于此，正如Tavilani等[14]提出的不育男性精液中缺乏对脂质过氧化的保护可能不是由于某一特定抗氧化酶活性的改变，而是由于几种抗氧化酶之间的协调作用。

细胞因子是精浆中天然成分的一部分，参与正常男性生殖生理。一些细胞因子的水平，如IL-6、IL-8和TNF-α，在不同的病理或精子参数改变的精液条件下升高[15]已被广泛接受,但也有报道细胞因子之间在不同生育者之间没有显著差异[16]。本研究结果是少弱精患者精液中细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α浓度均高于正常生育组，但不育症患者细胞因子IL-4的浓度低于正常生育组。这种差异可能是由于不同的群体特征和检测方法不同所致。ROS可诱导细胞因子的表达和产生，而细胞因子可调节ROS的产生和利用。有研究表明，几种促炎细胞因子，无论是单独还是共同存在，都能使精子质膜的LPO达到一定水平，从而影响精子的受精能力[17]。与氧化应激和脂质过氧化相关的精子质量差，部分可能是由于促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的作用。IL-1α和TNF-α等细胞因子可通过产生ROS和随后的脂质过氧化导致精子损伤[18]，表明细胞因子和氧化应激之间存在一定的关系。张大勇等[19]报道，IL-2可使精子中的SOD活性降低，增加了氧自由基的产生。最新的研究证实精液中IL-6与膜LPO呈正相关，精浆中IL-6浓度增加，精子中的LPO也会增加[20]。本研究不同组精浆氧化应激产物MDA浓度变化与IL-6、IL-8、TNF-α浓度变化相同，经相关分析,呈现正相关,但与IL-4呈负相关，提示不同的细胞因子与精子氧化应激之间的关系有待进一步研究。