类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞分子伴侣介导自噬增强与病情的相关性

邵鑫，蒋先虹，王瑞，刘福

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常见的慢性关节疾病之一，其特征在于滑膜细胞激增，并伴有炎性细胞因子和趋化因子分泌。其发病机制至今仍不明确。研究表明，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)的类肿瘤细胞样过度增值与自噬密切相关。根据机制，自噬分成三类：微自噬，巨自噬以及分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。在哺乳动物，研究较多的主要是巨自噬。CMA是一种严格的选择性蛋白质降解过程，允许蛋白质底物从胞质溶胶直接转移到溶酶体腔中，并依赖于伴侣蛋白Hsc70和溶酶体相关膜蛋白LAMP2A的共表达。通常情况下，自噬是在应激条件下促进细胞存活的一种调节方式，但过度激活自噬会导致细胞死亡。经过多年研究，CMA在体内平衡以及细胞、组织和器官功能中的作用越来越清晰：CMA的表达水平与多种疾病有关，包括溶酶体贮积病、免疫疾病、癌症甚至衰老。关于RA巨自噬的研究较多，其机制也逐渐明确，但由于CMA研究方法尚未成熟，关于RA CMA的研究尚少。目前，仍不确定CMA的表达水平与RA的发病机制是否相关。本研究以骨关节炎滑膜成纤维细胞(osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes，OA-FLS)作为对照组，检测分子伴侣自噬代表性因子Hsc70、LAMP2A在RA-FLS的表达水平，并探索其与RA患者临床指标的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

收集8例川北医学院附属医院骨科住院部RA患者的膝关节滑膜组织，培养原代RA-FLS，收集患者临床资料，所有RA患者均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟(American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism，ACR/EULAR)关于RA的诊断标准。同时收集性别、年龄匹配的8例骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者的膝关节滑膜组织，分离、培养原代OA-FLS作为对照组。该实验获得川北医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试者均知情并同意参与。8例受试者与8例对照者基本信息见表1。DAS28=0.56×SQRT(压痛关节数28)+0.28×SQRT(肿胀关节数28)+0.70×ln(ESR)+0.014×(患者健康状况评分)。

表1 受试者与对照者基本信息

LightCycler96实时荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏公司；凝胶成像系统购自法国Vilber Lourmat公司；激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。Ⅱ型胶原酶、胰酶、胎牛血清购自美国Gibco公司；引物购自生工生物工程上海股份有限公司；鼠抗人 Hsc70 单克隆抗体、兔抗人LAMP2A多克隆抗体购自美国abcom公司，鼠抗人-actin 单克隆抗体、IgG二抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗、罗丹明(TRITC)标记的二抗购自成都 ZenBioScience 公司；DAPI 染剂购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原代细胞培养、换液、传代及冻存：滑膜组织从手术室取出后，用Ⅱ型胶原酶消化4 h，过滤、离心，进行培养，1～3 d换液，约一周待培养瓶长满80%～90%后进行传代，按1∶2或1∶3进行传代培养，取3～ 8代活性较好的原代细胞进行后续实验。

1.2.2 RT-qPCR检测Hsc70与LAMP2A mRNA表达：取3～7代较纯化的对数生长期RA-FLS与OA-FLS细胞用于下续实验，采用RT-qPCR法分别检测RA-FLS与OA-FLS两组细胞Hsc70 mRNA和LAMP2A mRNA的相对表达水平。PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃反应5 s，60 ℃反应30 s，72 ℃反应20 s，40个循环。RT-qPCR产物检测结果：电泳后分别可见长度约为286、187、194 bp的条带，分别为Hsc70、LAMP2A、-actin的PCR产物，碱基序列见表2。

表2 实时定量基因碱基序列

1.2.3 Western blot检测Hsc70与LAMP2A蛋白表达：采用Western blot法检测RA-FLS与OA-FLS两组细胞Hsc70蛋白、LAMP2A蛋白的相对表达，具体操作步骤依次为：配制蛋白胶，80 V电泳150 min，200 mA转膜80 min，用5%脱脂牛奶封闭，孵育一抗、二抗，显影成像。Hsc70抗体稀释比例为1∶1 000，LAMP2A抗体稀释比例为1∶1 000。

1.2.4 免疫荧光检测Hsc70与LAMP2A蛋白的共定位表达：取对数生长期细胞接种于铺有爬片的6孔板中进行细胞爬片，每孔加入2 mL细胞悬液，2×10个细胞；过夜待细胞贴壁后弃培养基，PBS轻轻清洗2次；固定、透膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAPI复染核5 min，最后进行封片及检测，在共聚焦显微镜下观察细胞共定位表达，设置扫描参数，三通道扫描：各通道激发波长红色荧光TRITC为555 nm，绿色荧光FITC为490 nm，蓝色荧光DAPI为405 nm。

1.2.5 Pearson法分析Hsc70与LAMP2A蛋白水平与RA患者临床指标的相关性：采用Pearson法分析Hsc70与LAMP2A蛋白水平与RA患者血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、DAS28、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)的相关性。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 RA-FLS与OA-FLS分子伴侣介导自噬基因水平比较

RT-qPCR结果显示，RA-FLS与OA-FLS均存在Hsc70 mRNA和LAMP2A mRNA表达，RA-FLS组Hsc70 mRNA相对表达为(1.05±0.15)、LAMP2A mRNA相对表达为(1.01±0.06)，显著高于OA-FLS对照组Hsc70 mRNA表达(0.51±0.10)和LAMP2A mRNA表达(0.63±0.08)，两组比较差异均具有统计学意义(<0.05)(图1)。

2.2 RA-FLS与OA-FLS分子伴侣介导自噬蛋白水平比较

Western Blot结果显示，RA-FLS与OA-FLS均存在Hsc70蛋白和LAMP2A蛋白表达，RA-FLS组Hsc70蛋白相对表达为(1.02±0.08)、LAMP2A 蛋白的相对表达为(1.07±0.03)，均显著高于OA-FLS对照组中Hsc70的蛋白水平(0.78±0.06)，LAMP2A的蛋白水平(0.61±0.08)，两组相比差异均具有统计学意义(<0.05)(图2)

2.3 RA-FLS与OA-FLS Hsc70和LAMP2A蛋白共定位表达

用DAPI蓝色荧光标记细胞核，FITC-绿色荧光标记LAMP2A蛋白，TRITC-红色荧光标记Hsc70蛋白。共聚焦结果显示，与OA-FLS对照组相比，RA-FLS中红色和绿色荧光明显更强；且在RA-FLS中红绿荧光融合后的黄色荧光斑点显著高于对照组，表明Hsc70与LAMP2A蛋白的共定位表达增强(图3)。

2.4 RA-FLS分子伴侣介导自噬蛋白水平与RA患者临床指标的相关性

Pearson法分析结果显示，Hsc70蛋白水平与8例RA患者的DAS28得分呈正相关(=0.775 6)，与ESR、CRP、RF无明显相关性；LAMP2A蛋白水平与8例RA患者的DAS28得分、ESR呈正相关(分别为0.750 7、0.779 0)，与CRP、RF无明显相关性(图4)。

图 1 RA-FLS与OA-FLS Hsc70和LAMP2A mRNA相对表达水平

图 2 RA-FLS与OA-FLS Hsc70和LAMP2A蛋白相对表达水平

图 3 共聚焦显微镜观察RA-FLS与OA-FLS中Hsc70和LAMP2A蛋白共定位表达

图 4 Hsc70与LAMP2A蛋白水平与RA患者临床指标的相关性

3 讨论

侵袭性RA-FLS表型在RA的发病机制中起着至关重要的作用，RA-FLS以肿瘤样方式增殖并释放出大量介导RA关节破坏的促炎因子，是RA发病机制中的关键因素。以往研究数据表明RA-FLS细胞增殖活性增强并伴有巨自噬的激活，但RA-FLS细胞中的CMA水平是否高于正常水平尚未明确，本研究探索RA患者膝关节滑膜成纤维细胞中CMA功能水平。CMA不依赖于自噬体的形成，而是依赖于伴侣蛋白Hsc70和LAMP2A的共表达发挥作用。Hsc70与底物结合受到伴侣蛋白的调控，例如Hsc70相互作用蛋白，热激蛋白40和Hsc70-HSP90组织蛋白。实际上，大约三分之一的蛋白质组可以靶向CMA介导的降解，因为大约30%的蛋白质包含Hsc70靶向序列。本研究发现RA-FLS与OA-FLS对照组相比，Hsc70 mRNA及蛋白相对表达水平升高，提示RA患者细胞中可能有更多的Hsc70去结合含有KFERQ碱基序列底物，为CMA顺利进行奠定了基础。

一些研究表明，LAMP2A mRNA表达水平与CMA的发生呈正相关。在CMA中，首先，Hsc70识别含有KFERQ基序的胞质蛋白形成Hsc70-底物复合物，然后与溶酶体受体LAMP2A结合，底物被转运到溶酶体腔中进行降解消化。LAMP2A是一种Ⅰ型整合膜蛋白，可作为货物运输的孔，Hsc70-KFERQ底物复合物与LAMP2A C端胞质肽GLKRHHTGYEQ相互作用。LAMP2A溶酶体受体则是CMA途径的主要限制成分。有鉴于此，本实验比较RA患者和OA对照之间RA-FLS和OA-FLS中LAMP2A的相对表达水平，发现RA患者LAMP2A mRNA及蛋白相对表达水平明显增加。表明更多的LAMP2A可能与RA患者RA-FLS中的Hsc70结合，从而激活CMA途径。LAMP2A是CMA的受体和限制步骤，而Hsc70是CMA的关键载体。CMA途径主要依赖Hsc70-底物复合体与LAMP2A溶酶体膜受体结合而发挥作用，本研究共聚焦图像结果可以说明Hsc70和LAMP2A蛋白的共定位表达增强。

本实验将RA患者的临床资料进行相关性分析发现，Hsc70与LAMP2A蛋白水平与RA患者的病情活动度呈正相关，疾病表现越活跃，Hsc70与LAMP2A蛋白水平越高。提示Hsc70、LAMP2A可作为治疗RA疾病的作用靶点。

综上，RA发病机制可能与CMA活性增强有关，且Hsc70与LAMP2A蛋白水平与RA患者的病情活动度呈正相关，抑制CMA途径的激活可能成为控制RA疾病的有效方案。今后的研究可以从Hsc70与LAMP2A着手，探索分子伴侣介导自噬与RA-FLS的活化、凋亡及巨自噬的相关性，并研究其具体的通路机制。