LLNA∶BrdU-ELISA法与BT法检测5种农药 致敏性的对比研究

熊莉娟，贾 菠，刘 欢，周银平，万筱荣，刘永泉

(1.江西省职业病防治研究院，南昌 330006；2.江西省实验动物重点实验室，南昌 330006)

高效、低毒一直是国内外农药发展的目标，但由于各种因素的影响，农药在保障农业和林业生产的同时也会给人类健康带来一定的损害[1]。我国农药依据《农药登记管理办法》实行登记管理，农药登记必须提交农药的毒理学试验报告。为农药登记而进行的毒理学试验在国标《农药登记毒理学试验方法》中共分为28部分，其中皮肤变态反应(致敏)试验为第9部分。皮肤变态反应试验的目的是检测农药是否会引起人产生瘙痒等免疫源性皮肤反应[2]。评估农药皮肤致敏性的方法在国标中推荐的是局部封闭涂皮试验(BT)、豚鼠最大值试验(GMPT)和小鼠局部淋巴结分析试验(LLNA)。BT法和GPMT法的不足是使用动物数量多，试验时间长，结果依靠主观判定。LLNA法使用动物数量减少，小鼠替代豚鼠，试验时间缩短，结果更加客观，但存在放射安全和环境污染等问题，为推广应用带来困难[3]。LLNA∶BrdU-ELISA法是在细胞增生过程中将溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入细胞DNA中，用ELISA方法测定淋巴细胞中BrdU的量[4]。LLNA∶BrdU-ELISA法解决了放射性物质的污染问题，且试验周期短，操作相对简单，检测灵敏度高[5]，已被广泛应用于检测化妆品、化学品等各种试验[6-9]，但在农药检测方面未见系统的比较研究报道。本试验旨在对比LLNA∶BrdU-ELISA法和经典的封闭涂皮试验对受试物致敏性判断的能力，以探讨该方法替代封闭涂皮试验用于农药致敏性检测的可行性和准确性。

1 材料与方法

1.1 试验动物

8~10周龄的Balb/c小鼠，雌性，SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，试验动物生产许可证号：SCXK(湘) 2019-0004。体重250~300 g的Hartley豚鼠，普通级，购于长沙市天勤生物技术有限公司，试验动物生产许可证号：SCXK(湘) 2019-0015。小鼠和豚鼠分别饲养于江西省职业病防治研究院屏障系统动物房和普通动物房，试验动物使用许可证号：SYXK(赣) 2018-0006，温度20~ 25 ℃，湿度52 %~60 %。动物试验通过试验动物伦理委员会审查。

1.2 受试物

2,4-二硝基氯苯(DNCB)(上海化学三厂)，用丙酮/橄榄油AOO (sigma，Torres Y Ribelles S.A.)(体积比4∶1)配制成0.1% (质量体积比)浓度；己基肉桂醛(HCA)用AOO配制成25% (体积比)浓度，异丙醇、水杨酸甲酯和乳酸均用AOO配制成50% (体积比)浓度，以上4种化学物均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。5种农药为农药生产单位送检样品，标识齐全，分别为：5%阿维菌素乳油(青岛正道药业有限公司)、450 g/L咪鲜胺水乳剂(青岛金正农药有限公司)、40%噁草酮悬浮剂(青岛瀚生生物科技股份有限公司)、1.2%辛菌胺水剂(济南赛普实业有限公司)和250 g/L吡唑醚菌酯乳油(福建省德盛生物工程有限责任公司)。

1.3 主要仪器和试剂

AR224CN分析天平[奥康斯仪器(常州)有限公司]；ELX800酶标仪(美国BioTek公司)；R550IE多通道动物气体麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；游标卡尺、细胞筛网、PBS液(北京索莱宝公司)；BrdU粉剂、BrdU-ELISA试剂盒(Roche公司)。

1.4 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法

动物饲养1周后随机分组(4只/组)，设受试物组、AOO组和蒸馏水组。在试验第1、2、3 d在小鼠双耳背部分别涂抹受试物、AOO溶液和蒸馏水25 μL，涂抹前用游标卡尺测量耳厚度。试验第5 d每只小鼠腹腔注射BrdU标记液0.5 mL；注射后24 h采用七氟烷麻醉处死小鼠，测量耳厚度，取双侧耳后淋巴结称重后用玻璃匀浆器研磨。200目过筛后用PBS液重悬，将每只小鼠的淋巴细胞悬液定容至15 mL。

将100 μL淋巴细胞悬液加入到96孔板中，每只小鼠3个平行孔，1 200 r/min离心10 min。经试剂盒处理后用酶标仪检测吸光度(A)值(发射波长和 参考波长分别为370 nm、492 nm)。

BrdU标记指数=(As370-Ak370)-(As492-Ak492) 式中：As370为受试物组在370 nm波长的吸光度；As492为受试物组在492 nm波长的吸光度；Ak370为空白组在370 nm波长的吸光度；Ak492为空白组在492 nm波长的吸光度。

按照下列公式计算刺激指数(stimulation index，SI)，SI＜1.6为致敏阴性，SI≥1.6为致敏阳性。

1.5 豚鼠局部封闭涂皮试验方法

豚鼠试验分为10组，每组13只。2,4-二硝基氯苯组的诱导浓度为1.0%，激发浓度为0.5%；25%己基肉桂醛组的诱导浓度为25%，激发浓度为12.5%；乳酸、异丙醇和水杨酸甲酯的诱导浓度均为50%，激发浓度均为25%；1.2%辛菌胺水剂、250 g/L吡唑醚菌酯乳油、450 g/L咪鲜胺水乳剂、40%噁草酮悬浮剂以及5%阿维菌素乳油的诱导浓度为原样0.1 mL，激发浓度依据预试验结果定为原样1∶1蒸馏水稀释液0.1 mL，为不引起皮肤刺激的最高剂量；阴性对照组仅给予激发试验。

依据国标GB/T 15670.9—2017进行局部封闭涂皮试验，观察并记录激发接触后24 h、48 h和12 d的皮肤反应。按照局部封闭涂皮法的皮肤反应评分表进行评分，将试验组出现皮肤红斑或水肿(不论程度轻重)的动物数减阴性对照组出现皮肤红斑或水肿(不论程度轻重)的动物数所得的差除以动物总数，计算每组动物的致敏率并判定受试物的致敏强度。

1.6 LLNA∶BrdU-ELISA结果与传统试验数据的比较

将5种化学物和5种农药LLNA∶BrdU-ELISA法BALB/c小鼠的致敏性检测结果与豚鼠局部封闭涂皮试验检测结果及LLNA∶BrdU-ELISA法CBA小鼠文献数据比较。

1.7 统计分析方法

用SPSS 25.0对LLNA∶BrdU-ELISA法的试验结果进行分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVE)对耳厚差、淋巴结湿质量和BrdU标记指数等进行统计分析。如果差异有统计学意义，则进一步用Dunnett’s T3检验法对受试组与对照组进行两两比较。检验水准为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法的试验结果

0.1% 2,4-二硝基氯苯和25%己基肉桂醛的淋巴结湿质量以及BrdU标记指数有统计学意义(P＜0.01)。0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛、50%乳酸、5%阿维菌素乳油、1.2%辛菌胺水剂和250 g/L吡唑醚菌酯乳油的耳厚差差异均有统计学意义(*P＜0.05，**P＜0.01)。0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛和50%乳酸的SI均大于1.6。结果见表1。

表1 5种化学物和5种农药LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法检测结果

续表1

2.2 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)结果与文献数据比较

相关文献中[10]异丙醇LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法与BT法均为致敏阴性，与本研究结果一致，但文献中异丙醇LLNA∶BrdU-ELISA (CBA)法存在致敏假阳性结果。乳酸BT法试验结果为致敏阴性，而LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法和LLNA∶BrdU-ELISA (CBA)法小鼠结果[10]均有假阳性结果产生。其他化学物和农药的LLNA∶BrdU- ELISA (BALB/c)法与BT法结果均一致。结果见表2。

表2 5种化学物和5种农药LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法与BT法致敏性检测结果与文献数据的比较

3 讨 论

OECD指南TG442B推荐CBA小鼠，但该品系小鼠在国内使用量较少，繁殖周期较长，价格较高，不易推广应用；国内外有不少学者进行了研究证实BALB/c小鼠是替代CBA小鼠的较好选择，在国内应用较为广泛，遗传背景明确稳定[11-14]。本研究选取了5种化学物和5种农药，采用LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法对其致敏性进行评价。在本试验条件下，LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法中0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛和乳酸为致敏阳性，异丙醇、水杨酸甲酯、5%阿维菌素乳油、1.2%辛菌胺水剂、250 g/L吡唑醚菌酯乳油、450 g/L咪鲜胺水乳剂和40%噁草酮悬浮剂为致敏阴性。就“是或否”具有致敏性的判断来说，90% (9/10)的受试物判断结果一致，可以认为LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法和BT法对农药致敏性判断能力没有差异。由于受试物数量有限，故只能保守地认为LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法具有判断农药致敏性的潜能，是否可行还需要进行更大样本量的验证。

由于刺激物和致敏物均可对淋巴细胞产生增殖作用，会致使LLNA产生假阳性[15]，OECD指导原则TG442B中规定试验要观察给药动物的耳部红斑和耳厚度，一旦给药组动物耳厚度较对照组增加到25%以上，或红斑评分≥3，应下调给药浓度[16]。目前有研究通过增选刺激性指标(耳廓质量、耳厚差)对化学物的刺激性和致敏性进行全面评价[17-18]。本研究中通过耳厚差评价受试物的刺激性，5%阿维菌素乳油、1.2%辛菌胺水剂和250g/L吡唑醚菌酯乳油的耳厚差差异均有统计学意义。查阅本研究室相关急性皮肤刺激试验记录：5%阿维菌素乳油的刺激强度为中等刺激性，1.2%辛菌胺水剂和250 g/L吡唑醚菌酯乳油的刺激强度为轻度刺激性，表明耳厚差能对农药的急性皮肤刺激性进行初步判定。

农药可分为单剂和混剂，根据中国农药信息网的数据(数据统计截至2022年6月13日)，在登记有效期内的农药单剂数占总登记农药数的69%。本研究结果表明LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法具有判断农药单剂的致敏性的潜能，但其能否运用于判断农药混剂的致敏性还需进一步研究。