蜂蜜抑菌作用的研究进展及其遏制细菌耐药性的潜力

刘芮芮，史晶亮，黄渝岚，罗义,2,*

1.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津 300350

2.南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京 210093

几十年来，抗菌药物已经得到广泛的应用。但是由于人们对这类药物的长期使用，加速了其对耐药细菌的选择和传播，致使抗菌药物疗效降低，甚至无效，对全球公共卫生构成了极大的威胁。耐药细菌的广泛传播不仅导致疾病治疗周期延长，死亡率增加，也会对国民经济产生负面影响[1]。细菌对抗生素的适应性进化，导致抗生素的研发已经到了瓶颈期，新型抗生素的研发速度甚至赶不上细菌产生耐药的速度。因此，寻找一些新的抗菌药物来取代无效的抗菌药物成为迫切之举。蜂蜜作为一种天然抗菌物质，在抗生素出现之前就已经被用来治疗伤口和局部感染。如汉代时期在《神农本草经》中将蜂蜜列为药中上品，常用来治疗烧伤、慢性伤口和皮肤溃疡等[2]。

蜂蜜作为一种天然保健食品，是蜜蜂采集植物的花蜜等分泌物后，由工蜂在自身分泌物下充分混合酿造至成熟，进而储存在巢脾里的甜物质[3]。蜜蜂可以从一种或多种植物中采集花蜜来酿造蜂蜜，因此蜂蜜可以分为单花和杂花蜂蜜[4]。蜂蜜是一种成分复杂的物质，包含200多种不同的成分，如糖、水、有机酸、矿物质、酶、蛋白质、维生素、灰分、多酚化合物和植物衍生物等[4-5]。近年来蜂蜜抑菌和抗氧化特性被广泛认可，蜂蜜中的多酚类化合物、过氧化氢、丙酮醛、类黄酮和蜜蜂抗菌肽被认为是其抑菌活性的关键成分[6-7]。而蜂蜜的成分、颜色和风味因植物来源、气候和地理位置的不同而不同，其中植物来源对蜂蜜的抗氧化活性影响最大[6]。多项研究表明蜂蜜可以对抗多种耐药细菌或者可以逆转耐药细菌对抗生素的抗性[8-23]。因此，蜂蜜在用于临床治疗缓解多重耐药菌问题上表现出了巨大的潜力。

1 蜂蜜作为抗感染药物的早期应用(Early application of honey as an anti-infective drug)

野生蜂蜜的收集可以追溯到1万年前，在公元前7 000年左右的壁画中就描绘了当时人们采集蜂蜜的情景[4]。由于蜂蜜具有香甜的味道，古埃及、古中国、古希腊、古罗马和古印度的人们以蜂蜜为食[4]。而且早在公元前2 400年，埃及就已形成了养蜂技术，并且已经把蜂蜜作为天然的食物来源和食品添加剂[24]。蜂蜜作为药物使用也有数千年的历史记载[25]。古时候，埃及人、中国人、罗马尼亚人和亚述人将蜂蜜作为治疗肠道感染和促进伤口愈合的药物[7]。蜂蜜在不同时期，不同文化中有着不同的用途。在阿拉伯和印度医学家的古代医学文献中记录了蜂蜜对一些疾病的疗效[4]，古埃及人用蜂蜜作为局部药膏、伤口敷料和防腐物质，古希腊人用其治疗痛风、疼痛、发烧并用于促进伤口愈合[26]，并且在第二次世界大战期间，战地护士使用蜂蜜治疗伤员的伤口[27]。

蜂蜜在治疗表面伤口、烧伤和炎症方面应用颇多，后来一些蜂蜜逐渐发展成为医用级蜂蜜。1982年首次经研究证实蜂蜜具有抑菌活性[7]。随之经研究发现蜂蜜抑菌具有广谱性，它可以同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等[28-34]。1999年，蜂蜜首次在澳大利亚注册为外用药物制剂，从那以后，一系列基于蜂蜜的产品开始上市，包括无菌麦卢卡蜂蜜软膏和含有蜂蜜的敷料，但是在很大程度上，蜂蜜仍然没有得到广泛的应用，仅仅是在其他治疗方法失败后而采用的替代方法[27]。

2 抗生素的发明(Antibiotic invention)

抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的化合物。亚历山大·弗莱明(Alexander Fleming)、霍华德·弗洛里(Howard Florey)和恩斯特·钱恩(Ernst Chain)3人发现了人类历史上第一种广谱抗生素——青霉素，并于1945年获得了诺贝尔奖[35]。1943年10月19日艾伯特·沙茨成功从灰链霉菌中提取出了可以治愈肺结核病的“链霉素”，并于1944年成功用于临床[36]。以此为起点科学家们又陆续发现了四环类抗生素、氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素和安莎类抗生素等多种抗生素。由此，抗生素的发展进入了黄金时代。青霉素和链霉素成为人类进入抗生素时代的先锋，它们在肺炎、脑膜炎和结核等常见细菌性疾病的治疗中，发挥了重要的作用。抗生素的发明是人类医学史上最伟大的成就之一。但随着抗生素的发现和应用，使人们对天然抗菌疗法的兴趣急剧下降，蜂蜜也失去了其在治疗创伤感染中的先锋地位。

3 抗生素耐药性问题(Antibiotic resistance issues)

抗生素的问世在控制人类感染性疾病中发挥了重要的作用。但随着抗生素应用时间的延长，有研究发现相应剂量的抗生素却达不到应有的疗效[37-38]。据报道称起初青霉素对肺炎球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值为0.001～0.005 mg·L-1[37]，但于1965年检测出青霉素对该菌的MIC值达到0.1 mg·L-1[38]。这说明随着青霉素应用时间的延长，肺炎球菌对青霉素逐渐产生了抗性。而出现这一现象的原因之一在于人们对抗生素的滥用。美国疾病控制与防范中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)发现了20种具有耐药性的细菌菌株，并证明了它们与抗生素的过度使用有直接的关系[37]。这一情况在我国更为严重。中国原卫生部在2011年的报告中指出，中国医院对患者使用抗生素的频率高达70%～80%，比欧美等国家高46%～55%，但是其中用于预防感染的占比却高达40%，而在这40%中有1/3以上无需使用抗生素，因此造成抗生素的滥用[39]。除了上述情况，在养殖业和畜牧业中也存在抗生素滥用的现象。据报道称美国在2000年共消耗16 200 t抗生素，其中有70%用于兽药，抗生素长期过度使用，已经在养殖动物肠道内诱导出携带抗性基因(antibiotics resistance genes,ARGs)的菌株，这也是环境中抗生素抗性基因的重要来源之一[40]。耐药菌的出现使患者的治疗变得困难、昂贵甚至无法治愈，导致感染者死亡率上升。美国一篇报道称感染大肠杆菌耐药株患者的治疗费用要比感染敏感株的多38 121美元[41]，因此不少患者由于无法承担高效抗生素的费用而去世。世界卫生组织报告称，2012年全球估计有17万人死于多重耐药菌引起的肺结核[1]，在2016年的报道中更是提出如果不采取相应的措施，到2050年，抗生素耐药每年将导致1 000万人死亡[42]。除此之外，抗生素耐药问题也严重影响了全球经济稳定，世界银行指出，到2050年每年因抗生素耐药问题产生的全球经济损失接近于2008年的全球金融危机，可能导致全球年度GDP下降5%，使多达2 800万人陷入贫困[43]。面对这一严峻情况，世界卫生组织于2014年发布首份全球抗生素耐药报告，提出将抗菌素耐药(antimicrobial resistance,AMR)作为全球抗药性研究的重点之一[1]。

自然界中存在的细菌对抗生素产生耐药性是一种自然现象，而抗生素的过度或不当使用加速了细菌耐药的发生，通过药物压力的选择，那些获得抗生素耐药特征的细菌相比于易感细菌将更容易在环境中被保留下来[44]。不仅如此，耐药菌可以通过水平转移基因来传播抗性基因，从而增加了致病菌获得耐药性的机会[45]。致病菌获得性耐药为临床抗生素的治疗带来了巨大挑战。随着耐药菌的流行和暴发，特别是多重耐药菌(multi-drug resistant bacteria,MDR)的传播，抗击细菌耐药成为全球关注的焦点。

4 蜂蜜的抑菌作用(Antibacterial effect of honey)

抗生素的成功问世使人们忽视了蜂蜜在抗细菌感染方面的应用。但近几年随着抗生素耐药性问题的不断涌现，研究人员开始回顾抗生素发明前的时代，从而重新激起了对蜂蜜等天然抗菌剂的研究兴趣。目前的研究已经为蜂蜜的药用价值提供了证据[46-47]，这也促进了许多医用级蜂蜜产品在临床上的应用。临床上，采用局部氧疗联合蜂蜜加诺氟沙星湿敷对糖尿病足有显著的治愈效果[46]。此外还可以运用蜂蜜治疗呼吸系统疾病。有研究将蜂蜜与临床常用镇咳药苯海拉明作对比，发现蜂蜜的治疗效果优于苯海拉明，能够治愈儿童的严重感冒[47]。研究显示，蜂蜜可以对大约60种可引起人体感染的病原菌产生广谱抑菌活性[4]。多项研究表明麦卢卡蜂蜜可以在体外抑制耐甲氧西林的金黄葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)[48-52]，此外，麦卢卡蜂蜜还对具有高水平固有耐药和获得性耐药的细小支原体和解脲支原体显示出抑菌活性[53]。除了对麦卢卡这种医用级蜂蜜外，一些研究证实了普通蜂蜜也具有抑菌活性[18-23,31-34,54-56]。除此之外，蜂蜜被证明能有效缓解与伤口感染相关的炎症并促进其愈合[57]，特别在外伤抗感染中发挥了重要的作用，可有效降低一级和二级烧伤的发病率，并有助于减少康复所需的时间[58-59]。如有研究比较了麦卢卡蜂蜜涂层绷带与银涂层绷带在治疗恶性伤口方面的效果，发现蜂蜜涂层绷带在缩小恶性伤口方面与银涂层绷带效果类似[60]。也由此显示了蜂蜜用作药物在临床抗感染治疗中发挥的作用。表1列举了抗生素发明前后期不同地区及不同类型蜂蜜的抗感染应用。

表1 抗生素发明前期和后期蜂蜜的抗感染应用Table 1 Anti-infective application of honey before and after the invention of antibiotics

续表1抗生素发明后期Post-antibiotic invention非医用级Non-medical grade阿根廷Argentina柑橘、杂花蜂蜜Citrus, multifloral honey尼日利亚Nigeria野花、苦叶蜂蜜Wildflower, bitter leaf honey阿尔及利亚Algeria紫云英、桉树、桃花和杂花蜂蜜Astragalus sinicus, eucalyptus, peach, and multifloral honey加拿大Canada加拿大蜂蜜Canadian honey智利Chile芜茉蜂蜜Ulmo honey丹麦Denmark石楠、树莓、油菜、山楂和白三叶草蜂蜜Heather, rasberry, rapeseed, hawthorn, and white clover honey斯洛伐克Slovak蜜露蜂蜜Honeydew honey古巴Cuba牵牛花、红豆、黑红树和圣诞藤蜂蜜Morning glory, singing bean, black mangrove, and Christmas vine honey沙特阿拉伯Saudi ArabiaSider蜂蜜Sider honey中国China荞麦蜂蜜Buckwheat honey抑制非耐药菌Inhibition of non-antibiotic resistant bacteria金黄葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、摩根菌Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Morganella morganii[18]鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus[19]产气荚膜梭菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis[29]大肠杆菌、枯草芽孢杆菌Escherichia coli, Bacillus subtilis[31]大肠杆菌、铜绿假单胞菌Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa[32]金黄葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa[33]金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa[34]金黄葡萄菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis [54]金黄葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli[55]金黄葡萄菌、铜绿假单胞菌Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa[61]时期Period蜂蜜级别Honey grade地区District蜂蜜类型Honey type抗感染应用Anti-infection application微生物名称Microorganism name参考文献References

续表1抗生素发明后期Post-antibiotic invention非医用级Non-medical grade西班牙Spain桉树、鳄梨和栗子蜂蜜Eucalyptus, avocado, and chestnut honey克罗地亚Croatia栗子、槐花、酸橙、油菜和薄荷蜂蜜Chestnut, locust tree, lime tree, rapeseed, and mint honey荷兰NetherlandsRevamil蜂蜜Revamil honey摩洛哥Morocco芳香和药用植物蜂蜜Aromatic- and medicinal-plants honey加拿大Canada草木樨蓝莓、荞麦蜂蜜Sweet clover blueberry, buckwheat honey巴基斯坦Pakistan黑籽、Beri Shain蜂蜜Black seed, Beri Shain honey智利Chile芜茉蜂蜜Ulmo honey英国苏格兰Scotland, UK石楠、高地蜂蜜Heather, highland honey抑制耐药菌Inhibit antibiotic resistant bacteriaMRSA、MDR-S. pyogenes、MDR-E. coli、MDR-P. aeruginosa[13]MRSA、MDR-P. aeruginosa、MDR-A. baumannii、ESBL-E. coli[14]MRSA、MRSE、ESBL-E. coli、ESBL-P. aeruginosa、ESBL-E. cloacae、ESBL-K. oxytoca、VRE[20]MDR-E. coli、MDR-S. aureus、MDR-Bacillus spp.、MDR-P. aeruginosa[21]MRSA、VRE[22]MRSA[23]MRSA[32]PR-A. calcoaceticus、PR-S. aureus、PR-P. aeruginosa、PR-E. coli[56]

4.1 蜂蜜抑菌的主要成分和影响因素

长期以来，人们认为蜂蜜的抑菌作用归因于其较高的渗透压(水活度:0.562～0.62)和较低的pH值(3.2～4.5)，高渗环境导致细胞脱水致使细菌无法生长和增殖并且蜂蜜的酸度也低于细菌的生长适宜值(pH:6.5～7.5)[65]。有研究通过配制与蜂蜜相同浓度的糖水，发现也具有抑菌和杀菌活性[66]，这说明渗透压在蜂蜜的抑菌活性中发挥重要的作用。但有报道配制了一种与麦卢卡蜂蜜相同pH值和糖含量的人造蜂蜜，发现与麦卢卡蜂蜜相反的是这种人造蜂蜜并没有对任何微生物产生抑菌活性[67]。这说明蜂蜜抑菌机制除了与渗透压、pH有关外，其抑菌作用可能还与蜂蜜中的其他成分有关。蜂蜜中含有多种与抑菌活性相关的化合物，如过氧化氢、丙酮醛、酚酸、类黄酮和蜜蜂抗菌肽[68]。其中过氧化氢是在蜂蜜成熟期间，蜂蜜中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化生成[27]。并且大多数蜂蜜的抑菌活性与过氧化氢的含量呈剂量效应关系。Brudzynski[31]发现蜂蜜经稀释后其抑菌活性增强，原因可能是经过稀释后葡萄糖氧化酶更容易与葡萄糖结合，从而可以连续产生过氧化氢。此后多项研究也表明，对于大多数蜂蜜来说，在稀释倍数为30%～50%(V∶V)时可以产生较多的过氧化氢，并且过氧化氢的积累浓度范围为0.04～4 mmol·L-1[69-73]。目前，有研究评估了过氧化氢对蜂蜜抑菌活性的贡献，将蜂蜜用过氧化氢酶处理后发现其抑菌活性显著降低[74-76]。这表明过氧化氢参与了蜂蜜的抑菌过程。过氧化氢不仅参与蜂蜜的抑菌过程，还有研究发现其含量与蜂蜜的颜色有关，通常深色蜂蜜比浅色蜂蜜含有更多的过氧化氢[77]，但还未有研究证实深色蜂蜜的抑菌效果是否高于浅色蜂蜜。研究发现过氧化氢的抑菌机制主要是通过产生羟基自由基来抑制微生物活性，并且天然存在于蜂蜜中的Cu+或Fe2+等离子也可以经Fenton反应催化过氧化氢降解产生羟基自由基[75]。尽管过氧化氢被认为是蜂蜜的主要抑菌成分，但是一些蜂蜜的抑菌活性并不仅仅依赖于过氧化氢，蜂蜜中还包含其他抑菌活性物质，这种在含有较少过氧化氢或者在去除过氧化氢后的蜂蜜中观察到的抑菌活性被定义为非过氧化物活性[68]。非过氧化物活性与多种物质有关，其中就包括丙酮醛[68]。有研究称丙酮醛的最小抑菌浓度在10～1 000 mg·L-1的范围内[78]，是蜂蜜的另一主要抑菌成分。蜂蜜中的丙酮醛是由二羟基丙酮自发脱水生成的，而二羟基丙酮在悬钩子属(Leptospermumsp.)的花蜜中含量较高[79]。丙酮醛是麦卢卡(Manuka)蜂蜜的主要抑菌活性成分，后来将其称为独特的麦卢卡因子(unique Manuka factor,UMF)[80]，并且麦卢卡蜂蜜中的丙酮醛含量主要取决于二羟基丙酮的含量。起初人们认为只有麦卢卡蜂蜜含有丙酮醛，但是经研究发现一些北欧野花蜂蜜[81]，来自意大利不同植物的单花蜂蜜如桉树蜜、向日葵蜜和百里香蜜等[82]，芬兰野花蜂蜜[83]及葡萄牙蜜露蜂蜜[84]中也含有丙酮醛。但是这些蜂蜜中丙酮醛的含量(0.2～166 mg·kg-1)远低于麦卢卡蜂蜜(38～1 541 mg·kg-1)[73]。此外，蜂蜜中含有多种酚类化合物，这类生物活性物质是植物的次生代谢产物，主要是通过花蜜转移到蜂蜜中[85]。蜂蜜中的酚类化合物主要是酚酸和类黄酮，其在蜂蜜中的含量与其颜色相关，一般蜂蜜的颜色越黑，多酚和类黄酮的含量越高[27]。这类物质的浓度也影响蜂蜜的抑菌能力。Schneider等[86]发现薰衣草蜂蜜的抑菌活性低于麦卢卡蜂蜜，因为与麦卢卡蜂蜜相比，其多酚和类黄酮的含量较低。在对古巴蜂蜜的研究中发现，不同蜂蜜中多酚和类黄酮的含量有很大差异，但是这2种物质浓度较高的蜂蜜具有更好的抑菌性能[87]。虽然目前已经证明了蜂蜜中的酚类物质具有抑菌作用，但还需进一步研究多酚化合物影响蜂蜜的直接抑菌机制。除了植物源，蜜蜂分泌物也影响着蜂蜜的抑菌活性。蜜蜂defensin-1是在蜜蜂的血淋巴和咽下腺中发现的一种抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)[88]，蜜蜂在对蜂蜜进行初级加工时经唾液腺将其掺入到蜂蜜中[79]。由于这个原因，其在不同蜂种酿造的蜂蜜中差异很大[89]。蜜蜂defensin-1对真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制活性。其中主要对革兰氏阳性菌起抑制作用，如枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌，但其对多重耐药菌的抑制作用的研究仍十分有限[90]。

4.2 蜂蜜的抑菌机理

目前已经对蜂蜜的抑菌活性进行了大量的研究[14,31,49,66]，但是对蜂蜜抑菌机理的研究还不完善。由于麦卢卡蜂蜜是最常见的一种医用级蜂蜜，因此对其进行了多项针对微生物病原体抑制机理的研究，不仅麦卢卡蜂蜜，其他蜂蜜抑菌机理的研究近几年也不断在开展[51,91-94]。由于蜂蜜成分复杂，由数百种化合物组成。因此有人提出蜂蜜有多个细胞靶标来对抗细菌[27,51]。也正是由于蜂蜜的这种特性，目前只揭示出了几种蜂蜜的抑菌机制，这也在一定程度上限制了蜂蜜作为抑菌剂的大范围应用。迄今报道的蜂蜜主要抑菌机理如图1所示。

4.2.1 改变细菌的结构和形态

Henriques等[91]用扫描和透射电子显微技术来揭示蜂蜜的抑菌机理，如在对MRSA研究中发现麦卢卡蜂蜜不会造成细胞的裂解。但是之后有研究运用原子力显微镜和荧光显微镜却得到了与之相反的结果，经麦卢卡蜂蜜处理过的铜绿假单胞菌出现了大面积的结构性损伤，细胞中出现膜泡，这表明麦卢卡蜂蜜损伤了细菌细胞包膜，甚至还会导致细胞裂解和死亡[51]。后来有研究运用基因组分析进一步发现了麦卢卡蜂蜜通过降低细菌细胞膜膜蛋白OprF基因的表达从而引起细菌细胞膜的结构性损伤[95]。除了麦卢卡蜂蜜，研究还发现一些普通蜂蜜也会引起细菌细胞结构与形态等不同程度的损伤。荞麦蜂蜜和野花蜂蜜可引起大肠杆菌细胞壁的破坏，这与蜂蜜的浓度和作用时间有关[96]。鳄梨、栗子和野花蜂蜜可以破坏金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞膜，而且在相似的处理条件下，这3种蜂蜜样品比麦卢卡蜂蜜更能破坏细胞膜的完整性[79]。此外，Roberts等[97]的研究表明麦卢卡蜂蜜可以通过抑制铜绿假单胞菌鞭毛基因的表达，从而导致了鞭毛细胞的减少，由于鞭毛对于病原体的建立和产生侵袭性感染至关重要，因此这一发现对细菌细胞的形态变化具有重要的影响，说明蜂蜜还可以降低感染细菌的致病潜力。蜂蜜作用于细菌时可以改变其细胞的生长与形态，但是当不同种类的蜂蜜作用于不同细菌时，结果却有明显的差异。Lu等[98]发现麦卢卡蜂蜜、卡努卡蜂蜜和三叶草蜂蜜对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长和细胞形态具有明显不同的改变。当上述细菌暴露于这些蜂蜜的抑制浓度时，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出延长的迟滞期，在延长的滞后阶段，细菌细胞的长度变短，而铜绿假单胞菌细胞长度却变长。最近的研究运用流式细胞仪证实了之前的结果，确定了处理时间和蜂蜜浓度是诱导金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞膜损伤的关键因素[99]。

4.2.2 抑制细菌生物膜的形成

研究表明不同种类的蜂蜜具有抗黏附和抗生物膜特性，而自然界中的许多细菌都是以生物膜形态存在的[27]。细菌生物膜即将细胞包埋在由胞外多糖、DNA、蛋白质和膜囊泡组成的基质中，并因此形成了一种特殊抵抗外来压力的抗性机制，从而对抗生素产生耐药性[100]。有研究表明，在生物膜中细菌对抗生素的抵抗力比游离形态细菌细胞高，这使得它们极难被抑制[79]。因此生物膜也是细菌抵抗外界胁迫的一种保护性机制，最新研究表明4种新西兰蜂蜜可以抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，并且可显著消除已经建立的生物膜[101]。这很可能是通过非特异性机制，例如抑制细菌生长和减少生物膜生物量而形成的[79]。另外，蜂蜜也会显著降低已生成的生物膜的代谢活性，这可能是因为蜂蜜破坏了单个细菌细胞的代谢活性，而且在这个过程中，蜂蜜也会减少活细胞的数量[101-102]。蜂蜜对与生物膜形成和发育有关的不同基因表达也有影响[92]，而且蜂蜜可能通过下调编码结合蛋白的基因及抑制编码氨基葡萄糖聚合物的表达来阻止宿主组织的定殖[17,103-104]。

4.2.3 改变细菌的群体感应

群体感应是用于协调和调节细胞群体行为的细胞间通信系统。许多细菌的生理功能，如发光、毒性、运动性、孢子形成和生物膜形成，都受群体感应系统的调节[105]。由于这个原因，有人认为中断细菌群体感应可以减轻病原菌的毒力，是治疗病原菌所引起感染的一项新选择[106]。多项研究结果表明[92,103,107-108]，与菌群互作机制相关的一些基因以及其他毒力基因在暴露于蜂蜜后显著下调。另有研究发现，当蜂蜜和其他物质联用时(如姜黄素)则显著增强抗群体感应活性[93]。铁载体是在许多病原微生物中通过群体感应来调节的一组毒力因子，病原菌依靠铁载体与宿主竞争有效铁，使其能够在宿主环境中增殖[27]。铜绿假单胞菌利用铁载体绿脓素螯合人体宿主中的铁，经亚致死浓度蜂蜜处理后，该菌显著减少了铁载体产生，而绿脓素的产生与群体感应调节因子PvdQ、LasR有关[109]。类似地，亚致死浓度的蜂蜜通过降低las和rhl调节子及转录调节子MvfR的表达来削弱铜绿假单胞菌的群体感应[107]。除此之外，蜂蜜还可以通过抑制群体感应基因(csgBAC)来干扰大肠杆菌O157:H7形成生物膜[110]。这些也证明了蜂蜜可在基因水平上对病原菌毒力因子的表达产生显著影响。

4.2.4 干扰细菌的代谢

蜂蜜可以干扰许多细菌的代谢活动。有研究运用流式细胞仪证实了麦卢卡蜂蜜、鳄梨、栗子和野花蜂蜜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌代谢的影响[99,111]。这可能是因为麦卢卡蜂蜜减少了一些与细菌能量代谢有关的基因和蛋白质的表达[103]。但是，有研究表明麦卢卡蜂蜜对细菌代谢的影响是不可逆的，而其他蜂蜜对部分细菌的代谢活性会随着时间逐渐恢复，这可能与不同蜂蜜中的化学成分和蜂蜜的浓度有关[111]。蜂蜜中可能还存在其他潜在机制来影响细菌代谢。在对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌研究中证实了麦卢卡蜂蜜作为铁螯合剂的作用，这对于细菌的代谢和生存起着至关重要的作用[94,109]。另外，膜电位也是细菌产生能量的基本过程。蜂蜜会引起膜去极化来阻碍细菌产生生命活动所需要的能量，进而影响细菌的代谢活动[95,108,111]。

4.2.5 抑制细菌外排泵活性

多药外排泵是存在于细菌细胞膜上的一类蛋白质，通过外排泵系统细菌可以将进入细菌细胞内的抗菌药物移出细胞，从而使药物浓度低于其活性浓度，使细菌产生耐药[112]。这是细菌产生耐药性的重要机制之一。有研究采用流式细胞仪发现麦卢卡蜂蜜可以降低大肠杆菌AG100后代菌株的外排泵活性，该菌株暴露于高浓度四环素时会表达多个外排泵，但麦卢卡蜂蜜可以遵循剂量效应来阻止其外排泵的活性[99]。由于抗生素外排依赖于能量，因此他们认为蜂蜜抑制细菌外排泵的活性可能与其破坏细菌代谢有关。对此Bouzo等[108]假设麦卢卡蜂蜜可能是通过改变细菌细胞膜的通透性和降低细菌膜电位来增加细菌对抗生素的吸收，从而增强了抗生素的抑菌活性。这也证明了麦卢卡蜂蜜可以恢复一些耐药菌对抗生素的敏感性。

4.3 蜂蜜作为抗生素替代品的可行性

4.3.1 蜂蜜与抗生素抑菌效果的比较

蜂蜜具有不同程度的抑菌作用，但是蜂蜜的抑菌效果与抗生素相比是怎样的呢？因此许多研究试图将蜂蜜与常规抗生素的活性进行比较。Adeleke等[113]利用琼脂扩散法比较了铜绿假单胞菌和大肠杆菌暴露于蜂蜜和庆大霉素中的活性。该实验将这2种细菌暴露于未经稀释和用1∶2、1∶4和1∶6比例稀释的蜂蜜，结果表明未经稀释的蜂蜜及其1∶2至1∶6的水稀释液对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制率分别为100%和96.4%；但是庆大霉素以8.0 mg·L-1和4.0 mg·L-1的浓度使用时通常显示出较低的抑菌活性。还有研究发现，与25 000 mg·L-1的四环素相比，纯浓度的蜂蜜可以抑制除大肠杆菌之外的所有被测菌株[114]。

蜂蜜对耐药菌表现出广泛的活性。因此有人提出将抗生素与蜂蜜联用，并对此进行了多项研究[111,115-116]。目前已经开发出了各种抗生素和蜂蜜联用组合，并取得了良好的效果。一项研究比较了阿曼不同地区的30份蜂蜜样品对金黄色葡萄球菌的抗菌能力，发现50%的蜂蜜样品在1 h后对金黄葡萄球菌的抑制率为45%，浓度为4 mg·L-1的庆大霉素对该菌的抑制率为88%，但当蜂蜜与庆大霉素联用时对该菌的抑制率大大提高[117]。除了庆大霉素，蜂蜜与其他抗生素的组合也取得了较好的效果。当麦卢卡蜂蜜与利福平、四环素和粘菌素配合使用时可以增强对铜绿假单胞菌的抑制效果，与四环素、亚胺培南和莫匹罗星在抑制MRSA时具有协同作用[52]。

此外，蜂蜜与抗生素联用还可以逆转耐药细菌对抗生素的抗性。研究表明麦卢卡蜂蜜和甲氧西林的协同作用使MRSA重新对甲氧西林敏感，分子分析表明这可能是由于蜂蜜影响了mecR1基因的表达[115]。这些发现为蜂蜜在临床中的应用奠定了基础，特别是对于慢性感染疾病的治疗。但是目前还没有阐明发生这种协同作用的机制。针对这一问题有人提出至少部分原因是由于蜂蜜的存在增加了羟基自由基的产生，不过还必须考虑其他因素，因为麦卢卡蜂蜜中的过氧化物活性对于完全抑制细菌生长不是必不可少的[118]。然而我们应了解并不是所有蜂蜜的抑菌效果都优于抗生素。2 000 mg·L-1的环丙沙星对金黄葡萄球菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的抑制效果优于浓度为50%(V∶V)的蜂蜜溶液和纯蜂蜜[114]。因此，蜂蜜还不能完全替代抗生素，并且我们还需要进一步的研究来筛选合适的蜂蜜类型去抑制特定的病原菌。总的来说，蜂蜜的抑菌活性已经得到了证实，然而，研究人员还未得出蜂蜜抑菌的确切浓度范围。由此可见，虽然蜂蜜的抑菌效果优于部分抗生素，但是蜂蜜单独作用以及与其他抗生素联用对细菌特别是对病原菌的抑菌作用机理还存在许多未知，亟待开展相关的研究，这对于遏制抗生素耐药性的发生和发展具有重要的意义。

4.3.2 细菌对蜂蜜的抗性

蜂蜜是具有复杂成分的天然物质，研究表明这是它作为抑菌剂的主要优点之一，蜂蜜中的数百种化合物可能存在多个细菌靶标，使细菌难以适应它们，因此难以产生抗蜜性[27]。从开始将麦卢卡蜂蜜运用到医疗中截止到目前，还未发现有细菌对麦卢卡蜂蜜产生抗性[119]。这可能是因为麦卢卡蜂蜜的组成成分复杂且相互之间存在协同作用，给细菌不同的作用压力而使其无法产生抗性。

Blair等[63]的研究首次证明了具有耐药表型的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌持续暴露于亚致死浓度的麦卢卡蜂蜜时没有产生抗蜜性。之后，有研究将不同细菌的临床分离株在亚致死浓度的蜂蜜中连续暴露10 d，结果表明细菌不可能在短期的暴露实验中产生抗蜜性，接着又在28 d中逐步增加蜂蜜浓度培养细菌菌株来完成体外测定，依然不能筛选出抗蜜的细菌突变体，这些结果说明了与抗生素不同的是细菌很难对亚致死浓度的蜂蜜产生抗性[119]。此外，细菌对2种不同的抗生素会产生交叉抗性。当金黄葡萄球菌持续暴露于亚致死浓度四环素时，该菌对四环素的抗性较亲代高64倍，并且对苯唑西林的抗性提高了32倍，但是当该菌暴露于亚致死浓度蜂蜜时，并没有显示出对蜂蜜的交叉抗性[63]。这说明细菌对蜂蜜产生抗性的可能性极低，并且蜂蜜的使用也不会影响其他抗菌药物的疗效。

4.3.3 研发的经济成本

随着抗生素耐药性问题日趋严重，新抑菌药物的研发迫在眉睫。新合成的抗生素药物越来越少，截至目前，最后一种全新的抗生素是在20世纪80年代末研发的[120]。造成这一现象的原因是开发新型抗生素并将其推向市场对于制药公司来说往往无利可图。于2017年公布的一项调查数据显示，开发一种新的靶向抗生素的成本为1.581亿美元[121]，然而与高昂的成本相比，制药公司每年的收入却为4 600万美元[121]。因此许多大型制药公司退出了该市场。抗生素高昂的研发成本使得开发新型抗生素这一举措不再是长久之计，因此当前可以着眼于抗生素发明前期一些成本低廉且有效的抑菌化合物。蜂蜜作为一种古老的抑菌物质，在抑菌药物的开发中具有巨大的研发潜力。有研究强调蜂蜜敷料不仅可具有比普通敷料高2倍的治愈率及较好的治疗效果，更重要的是所用蜂蜜成本低廉[122]。除此之外，目前药用蜂蜜的开发已经带来了一些经济效益，2010年美国《金融评论》估计蜂蜜应用于伤口治疗的市场价值为14万亿美元[123]。因此在这个预算限制和医疗资源优化的时代，研究和开发有效且低廉的治疗方法是大势所趋。因此在理论上，将成本低廉的蜂蜜纳入到对抗多重耐药菌的新型抗生素研发中是可行的。

5 展望(Prospect)

抗生素耐药菌的出现及其传播已对全球公共卫生安全构成了极大的威胁，是全球急需解决的健康问题之一。蜂蜜不仅具有高营养的特点，更具备抑菌活性，与开发新型抗生素相比，开发蜂蜜用作抑菌药物的潜力巨大，对于遏制日益严重的细菌耐药甚至超级细菌的感染将发挥更大作用。未来，还需围绕以下几方面重点开展研究。

(1)蜂蜜体内抑菌活性的研究。目前，蜂蜜的体外抑菌性能已经得到了大量的实验室研究证实，还需开展大规模临床实验来验证蜂蜜在体内与体外的抑菌活性是否相一致。

(2)蜂蜜抑菌机制的研究。蜂蜜的成分复杂，各成分的抑菌效果及其相互的作用机制还不清楚，还需进一步的研究阐明其抑菌作用机制。

(3)作为药用蜂蜜的健康风险评估研究。蜂蜜中可能存在一些致病菌的孢子并且可能受到如除草剂、杀虫剂、重金属和抗生素等化学品和农药的污染。因此需要加强蜂蜜作为药用的健康风险评估研究，制定相应的蜂蜜药用标准。

(4)中国商品蜂蜜抑菌作用的研究。中国作为蜂蜜生产和出口大国，目前有关中国蜂蜜抑菌性能的数据还相当有限，还需进一步加强相关研究，开发出我国具有独立自主知识产权的蜂蜜抑菌剂。