单宁酸对湖羊瘤胃动态发酵和血清抗氧化能力的影响

■张振东 刘 婷 范慧玉 张建军 徐建风 沈振峰 张 帆 郑 琛

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

单宁是植物次生代谢过程中产生的多种酚类化合物，根据化学结构分为缩合单宁和水解单宁[1]。高浓度的单宁在动物口腔内与唾液蛋白发生互作，引起口腔黏膜粗糙褶皱的干燥感，苦涩的味道，引起口腔内组织的收敛性增加，降低饲料的适口性。单宁酸也称鞣酸，是单宁代谢过程中的次级产物，且单宁酸分子内的酯键能与蛋白质、多糖和金属离子结合降低养分的消化率[2]，但对于反刍动物而言，适量的单宁酸能够保护瘤胃蛋白质，增加过瘤胃蛋白质含量。目前对于反刍动物饲粮中添加单宁酸的研究主要集中在提高饲料效率、影响瘤胃微生物菌群活性、减少瘤胃甲烷排放和增加十二指肠微生物蛋白和氨基酸流通率等问题上[3-7]，但对于饲粮添加单宁酸对绵羊瘤胃发酵过程的动态变化却鲜有报道。基于此，试验旨在研究饲粮中添加2%的单宁酸对湖羊血清抗氧化指标、瘤胃pH和发酵参数动态变化的影响，探讨单宁酸对湖羊瘤胃发酵功能的调控作用，为单宁酸在反刍动物中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及动物

本试验采用交叉试验设计，选择6只安装永久瘘管的湖羊，随机分成对照组（基础日粮）和单宁酸组（基础日粮+2%单宁酸），每组3 只羊。试验分为2 期进行，每期15 d。

1.2 试验饲粮

参照中华人民共和国农业行业标准《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）配制单宁酸组和对照组的颗粒饲粮，饲粮组成及其营养水平见表1。所用饲粮均由甘肃润牧生物工程有限责任公司生产加工。营养水平中除了消化能其余均为实测值，粗蛋白的测定采用凯氏定氮法，试验仪器包括粉碎机、分析天平、凯氏定氮仪、40目筛、电炉等；粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法，试验仪器有索氏提取器、脱脂滤纸等；钙含量的测定采用高锰酸钾滴定法，磷含量的测定采用钼黄比色法，试验仪器有分析天平、锥形瓶、滴定管、比色皿、分光光度计；酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）的测定采用十二烷基硫酸钠溶液（中性洗涤剂）和十二烷基三甲基溴化铵（酸性洗涤剂），试验仪器有电炉、锥形瓶等。

表1 饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 饲养管理

试验开始前，对羊舍进行全面消毒，并对所有羊进行布鲁氏杆菌检测。试验期间所有羊只单笼饲养，每天在8：00和17：00分别饲喂一次，自由饮水和采食。过渡期试验开始时将6只瘘管羊随机分成对照组和单宁酸组，每组3只，按相应分组饲喂不同饲粮10 d，然后进入正试期，进行瘤胃动态pH和样品采集。

1.4 试验样品采集

1.4.1 瘤胃动态pH数据采集

参考胡红莲等[8]的方法测定瘤胃动态pH。在正试期前2 d，采用动态pH 监测系统对试验羊瘤胃pH进行24 h 动态监测。在每次进行动态pH 连续监测时，用pH 4.00 和pH 6.86 标准液对电极进行校准，并记录校准值。待电极校准完毕后，将电极通过瘤胃瘘管插入瘤胃内，然后塞好塞子。电极通过导线与瘘管外的pH变送器信号输入端相连，pH变送器的信号输出端与记录仪的信号输入端相连接。本试验用3 个通道进行实时显示，每期6 只试验羊的pH 动态变化分2 d完成，并设定每隔1 min记录1次pH，选择其中稳定的一天进行后续动态pH的数据分析。

1.4.2 瘤胃液样品和血清样品采集

正试期结束前2 d分别采集食后0、1、3、5 h和7 h的瘤胃内容物，用4层纱布过滤瘤胃食糜，将过滤后得到的瘤胃液装入10 mL 离心管，随后立即在-80 ℃保存，用于测定挥发性脂肪酸（volatile fatty acid, VFA）和氨氮浓度。同时，使用非抗凝管分别采集食后0、1、3、5 h 和7 h 的颈静脉血液并制备血清。将血清转入2 mL离心管后置-80 ℃保存，用于测定抗氧化指标。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 瘤胃发酵参数测定

瘤胃液在5 000 r/min离心10 min后取1 mL上清液置于1.5 mL 离心管中，加入0.2 mL 25%的偏磷酸溶液（含内标物2-乙基丁酸），充分混匀后置于冰水浴30 min以上，然后在10 000 r/min离心10 min，取出离心管后用移液枪移取上清液于气相小瓶中上机测定。

使用安捷伦6890N 气相色谱仪和HP 19091N-213 色谱柱测定VFA。色谱分析条件为：进样口温度为220 ℃，分流比为40∶1，氮气流量为2.0 mL/min。检测器温度为250 ℃，空气流量为450 mL/min，尾吹气流量为45 mL/min，氢气流量为40 mL/min。程序升温：初温为120 ℃3 min，后以10 ℃/min 升温至180 ℃，并保持1 min。进样量为0.6 μL。

参考孙康等[9]的方法测定瘤胃液中氨氮含量。瘤胃液5 000 r/min离心10 min后移取1 mL上清液转入10 mL 离心管中，加入4 mL 0.2 mol/L 盐酸后摇匀。然后吸取混合液0.2 mL，置于5 mL离心管内，依次加入A液（含有0.08 g亚硝基铁氰化钠的100 mL 14%水杨酸钠溶液）1 mL 和B 液（含有2 mL 次氯酸钠溶液的100 mL 0.3 mol/L NaOH 溶液）1 mL，充分摇匀，静置10 min。然后移取200 μL 混匀液置于96 孔板中，使用酶标仪测定波长700 nm下的吸光度值。根据氨氮标准曲线计算瘤胃液中氨氮含量。

1.5.2 瘤胃动态pH测定

将每只羊每天所采集的pH数据进行汇总，计算平均值、最大值、最小值，以及pH低于5.60和5.80的持续时间及曲线面积。并计算每小时平均pH，用于绘制24 h动态pH变化图。参考李飞等[10]方法计算以上参数。

1.5.3 血清抗氧化指标的测定

使用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒测定血清中的谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）含量。

1.6 数据统计分析

利用SPSS 23.0软件包对试验数据进行一般线性混合模型单变量方差分析，并对处理组间进行独立样本t检验。试验结果以“平均值±SEM”表示，用P值作为衡量显著性指标，P≤0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加单宁酸对湖羊干物质采食量的影响（见图1）

图1 饲粮中添加单宁酸对湖羊干物质采食量的影响（n=6）

由图1可知，饲粮中添加单宁酸对湖羊干物质采食量无显著性影响（P＞0.05）。

2.2 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃发酵动态变化的影响（见表2）

表2 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃发酵动态变化的影响（n=6）

表2（续） 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃发酵动态变化的影响（n=6）

由表2可知，饲粮中添加单宁酸显著提高湖羊瘤胃丁酸摩尔比和异戊酸摩尔比（P＜0.05），而显著降低瘤胃氨氮浓度和总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acid，TVFA）含量（P＜0.05）。湖羊采食含单宁酸的饲粮后瘤胃TVFA、丙酸摩尔比会随时间的增加显著升高（P＜0.05）；异戊酸摩尔比和乙丙比会随时间的增加显著降低（P＜0.05）；其中，湖羊采食试验饲料后瘤胃TVFA呈现先提高后降低的显著变化。处理和时间对湖羊瘤胃TVFA 含量、异丁酸摩尔比、异戊酸摩尔比和乙丙比产生了显著的交互作用（P＜0.05）。

2.3 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃pH 动态变化的影响（见表3、图2）

表3 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃pH动态变化的影响（n=6）

虽然饲粮中添加单宁酸对瘤胃pH动态指标无显著性影响（P＞0.05），并且单宁酸组与对照组湖羊采食饲粮后24 h 瘤胃pH 动态变化相似，见图2；但7 h 时单宁酸组湖羊瘤胃pH显著高于对照组（P＜0.05）。

图2 湖羊采食添加单宁酸饲料瘤胃pH24 h动态变化（n=6）

2.4 饲粮中添加单宁酸对湖羊血清抗氧化指标动态变化的影响（见表4）

由表4 可知，饲粮中添加单宁酸显著提高湖羊血清MDA 含量和GSH-Px 活性（P＜0.05），显著降低T-SOD 活性（P＜0.05）。湖羊采食含单宁酸饲粮后血清中T-AOC 呈现先降低后升高的变化。但处理与时间对羊血清抗氧化动态变化没有产生显著的交互作用（P＞0.05）。

表4 饲粮中添加单宁酸对湖羊血清抗氧化指标动态变化的影响（n=6）

表4（续） 饲粮中添加单宁酸对湖羊血清抗氧化指标动态变化的影响（n=6）

3 讨论

3.1 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃发酵动态变化的影响

饲粮组成是影响反刍动物干物质采食量的重要因素，本试验中湖羊饲喂含2%单宁酸的饲粮，就干物质采食量而言没有和对照组产生显著差异，这与Hatami 等[11]的试验结果一致，可能原因是低浓度单宁酸对适口性没有显著影响。反刍动物对饲料来源的蛋白质沉积率很低，主要是因为这些蛋白质大部分以氨氮的形式在瘤胃中损失。本试验中，饲粮中添加单宁酸显著降低湖羊瘤胃氨氮浓度，表明单宁酸有效降低了瘤胃蛋白质降解率。这主要是因为游离单宁能够与饲粮中可溶性蛋白结合，从而降低瘤胃内氨氮浓度[12]。此外，瘤胃内氨氮浓度也会随着瘤胃微生物数量的减少而降低，可能是因为单宁酸能够抑制瘤胃微生物菌群数量所致[13]。

本试验中，饲粮添加单宁酸显著降低湖羊瘤胃TVFA 浓度，表明单宁酸抑制了瘤胃内碳水化合物的降解。这可能是因为单宁酸与碳水化合物结合后抑制了某些瘤胃微生物菌群所引起的[14]。前期研究发现添加单宁酸能够显著提高湖羊瘤胃内丙酸和丁酸的比例，从而改变乙酸与丙酸比例，但并未对纤维类碳水化合物的降解造成影响，这可能是因为饲粮中添加单宁酸能够显著影响非结构性碳水化合物的发酵[15]。本试验中单宁酸显著提高了湖羊瘤胃内丁酸比例，而显著降低了丙酸比例，Geerkens 等[16]也得到了相同的试验结果。饲粮中碳水化合物的结构和组成是影响瘤胃内VFA含量和比例的主要因素，这可能是本试验和前期研究结果之间存在差异的原因。

3.2 饲粮中添加单宁酸对湖羊瘤胃pH 动态变化的影响

瘤胃pH是反映瘤胃内环境稳态和发酵程度的重要指标。瘤胃缓冲物（碱性物质，如氨氮）、VFA 浓度和食糜流通速率都是引起瘤胃pH 变化的主要因素。前期研究发现瘤胃pH 的最适范围在5.5～7.5 之间[17]，一般在饲喂2～6 h内达到最低值，然后逐渐回升，最后瘤胃内趋于稳定[18]，这与本试验结果相似。本试验中，7 h时单宁酸组湖羊瘤胃pH显著高于对照组，李晓鹏[19]在体外发酵试验中也得到了相似的试验结果。但其他时间点，两处理组湖羊瘤胃pH 均无显著性差异。可能原因是单宁酸对瘤胃微生物有抑制作用，可以使微生物的发酵性能受到影响，降低了有机物在瘤胃内的降解，减少了TVFA 的含量，从而引起采食后瘤胃pH的升高。

3.3 饲粮中添加单宁酸对湖羊血清抗氧化指标动态变化的影响

动物体内含有大量的超氧阴离子自由基。在正常情况下，这些超氧阴离子自由基处于动态平衡状态。但在动物生长发育过程中，可由外部和自身等原因引发氧化应激，动物在代谢过程中会在体内产生大量超氧阴离子自由基，其超强的氧化性降低机体抗氧化能力[20]，从而导致动物机体出现疾病[21]。但是机体内也会产生大量的抗氧化酶（SOD、GSH-Px），它们可以清除机体内因为应激而产生的大量自由基，从而使机体恢复到正常状态。前期研究发现饲粮中添加单宁酸对动物具有保健功能[22-23]，刘华伟[24]研究表明单宁酸可以提高肉兔血清中的SOD含量，魏海峰[25]报道单宁酸可以降低湖羊血清中的MDA 含量，提高SOD含量，本试验也得到了相同的结果。动物可以通过抗氧化作用清除体内自由基等物质来提高机体免疫能力，本试验中添加单宁酸显著提高了抗氧化酶的含量，这就暗示着单宁酸可以提高了机体的抗氧化能力。但单宁酸在湖羊瘤胃内经过瘤胃微生物降解和酸性水解后释放多种酚类物质（如没食子酸、焦棓酸和间苯二酚等）[26-27]，这些单宁酸有毒分解产物通过毛细血管到达肝脏，经过肝脏的解毒作用来减少有毒分解产物对机体的危害，当超过肝脏的解毒能力时，动物就会出现中毒症状。因此，如何正确合理地在湖羊饲粮中添加单宁酸，有待进一步研究。

4 结论

湖羊饲粮中添加2%的单宁酸会降低瘤胃TVFA和氨氮含量，但能够提高丁酸比例和维持瘤胃pH 稳定，具有保持瘤胃内环境稳态和提高血清抗氧化能力的作用。