发病盔形溞沃氏葡萄球菌的分离与鉴定

曹雅芹，戚惠颖，徐大勇，赵雅洁，顾东萍，黄金飞，邓道贵

(淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北 235000)

溞属种类是一类常见的淡水枝角类甲壳动物，它们既滤食水体中的浮游藻类、有机碎屑和细菌；又因其具有繁殖率高、营养丰富、易培养、运动缓慢等特点，又是鱼类的天然饵料，它们是水生生态系统食物链的重要组成部分。几丁质是自然界中十分丰富的合成聚合物，广泛存在于昆虫外骨骼、甲壳动物的外壳(包括溞属种类的壳刺)、真菌细胞壁等生物体中，主要对生物体起保护作用。目前，已有研究者对虾蟹类的几丁质及几丁质衍生物的特性开展了研究。另有研究表明，从虾、蟹和真菌中提取的几丁质具有抗菌活性。

葡萄球菌是一种革兰氏阳性的球形细菌，广泛分布于自然界、人与动物的皮肤和黏膜上，通常排列成葡萄串状。VON EIFF等认为，葡萄球菌属中的一些种类(包括沃氏葡萄球菌)是一类新的致病菌。沃氏葡萄球菌的毒性弱于金黄色葡萄球菌，通常可以在人体表面、动物和发酵食品中检测到。葡萄球菌属种类不仅广泛分布在热带海水、沉积物、藻类和无脊椎动物中，也被发现在亚热带海洋鱼类和淡水鱼类中。目前，有关沃氏葡萄球菌侵染鱼类、引起致病的研究已有一些报道。

在自然水体中，溞属种类壳刺断裂的现象十分普遍，但其发生机理尚不清楚。本文利用平板分离技术，以16S rDNA基因作为分子标记，对发病盔形溞进行了病原分离与鉴定，旨在为溞属种类壳刺断裂的病原机理提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和培养基

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，Taq Plus DNA聚合酶，GeneRuler DNA Ladder Mix，几丁质等均购自生物工程(上海)股份有限公司。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂粉18 g/L，pH 7.0；LB液体培养基不加琼脂粉。

胶体几丁质液体发酵培养基：0.03% KHPO，0.07% KHPO，0.002% FeSO，0.05% MgSO·7HO，0.001% ZnSO，1.5% 胶体几丁质，pH 7.0。

胶体几丁质固体筛选培养基：液体培养基基础上添加1.6%琼脂。胶体几丁质的制备参考苗飞等的方法。

1.2 引物

16S rDNA引物为细菌性检测通用引物27F和1492R，即27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 盔形溞的培养及鳙鱼水的配制

盔形溞()来自巢湖休眠卵的孵化。孵出的盔形溞幼溞投喂斜生四链藻()，在温度(25±1)℃、光暗比为12 h∶12 h、光照度为2 500 lx的条件下培养，成熟后产出的第三代幼溞(出生<6 h)用于实验。

鳙鱼水配制：从鱼塘中购买新鲜的鳙鱼(约1 kg)放养在水缸中，注入15 L的曝气48 h以上的自来水，2 d后收集鳙鱼水，用0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 发病盔形溞的来源

发病盔形溞来自本实验室，盔形溞()在鳙鱼水培养下出现壳刺断裂的现象。实验时，将第三代盔形溞幼溞(出生<6 h)分成试验组与对照组，每组15只。试验组每只分别放入50 mL的烧杯中，加入40 mL的培养液(含有20%鳙鱼水和80%曝气自来水)，对照组分别加入40 mL 100%曝气自来水。实验期间，在Olympus CX21显微镜下观察盔形溞的壳刺形态变化。

1.5 发病盔形溞的细菌菌株分离及形态观察

收集实验期间出现壳刺断裂现象的盔形溞(图1)，先用无菌解剖刀切取壳刺，使用无菌水冲洗几遍，再用无菌枪头捣碎后接种于LB液体培养基，37 ℃下震荡培养4～5 h。取少许菌液，采用涂布法均匀涂布到LB平板。挑选单菌落，并进行纯化，经纯化后的细菌再接种到胶体几丁质固体培养基上观察是否有菌落产生。

图1 鱼水培养引发的盔形溞壳刺断裂现象Fig.1 Broken tail spine of D.galeata under fish-water culture图A、B是鱼水培养下引发的盔形溞壳刺断裂的现象，图C是正常盔形溞的壳刺

用接种环随机挑取9个单菌落并分离纯化，对纯化后的菌株进行涂片，革兰氏染色，在Olympus CX21 显微镜下观察细菌形态。

1.6 分离菌株的16S rDNA扩增及系统进化树的构建

按照潘晓磊等的方法，以分离菌株的DNA作为模板，采用细菌16S rDNA基因通用引物27F和1492R，对目标菌株进行PCR扩增。采用25 μL PCR反应体系：10×PCR Buffer、dNTP(each 10 mmol/L)、Taq Plus DNA Polymerase(5 U/μL)、50 mmol/L MgSO共计12.5 μL，上、下游引物各1 μL，Template(DNA) 1 μL，ddHO 9.5 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min。对PCR扩增产物进行纯化，由生物工程(上海)股份有限公司完成测序。

将9个分离菌株16S rDNA测序结果拼接后，通过NCBI/BLAST进行序列比对，使用MEGA 7.0软件，用Neighbour-Joining法构建系统进化树，确定其属种。

然后，将纯化的菌株在液体LB培养基37 ℃下震荡培养10～12 h，使用稀释涂布平板法计算菌液浓度，用于分离菌株的致病性试验。菌种和50%甘油按照1∶1的比例保存于-80 ℃。

1.7 分离菌株致病性试验

将没有受到鳙鱼水侵染的第三代盔形溞幼溞(出生<6 h)设置试验组与对照组。试验组与对照组分别设3个平行，每个平行5个盔形溞，每个平行的盔形溞均放入含100 mL无菌蒸馏水的150 mL锥形瓶中。每个平行盔形溞的锥形瓶中接种菌液浓度为9.2×10CFU/mL，在25 ℃下智能光照震荡培养箱中培养，转速为40 r/min 。在Olympus CX21显微镜下观察分离菌株对盔形溞的致病性。

当分离菌株侵染正常盔形溞致病后，取病灶(盔形溞断裂的壳刺)进行分离纯化细菌，16S rDNA分子标记测序，检验此菌株与原分离菌株是否一致。

2 结果

2.1 分离菌株的形态特征

纯化后的分离菌株在胶体几丁质培养基中培养，均出现湿润、表面光滑、隆起的乳白色圆形小菌落(图 2A)。挑取单个菌落涂片进行革兰氏染色镜检，结果均显示革兰氏染色阳性，显微镜下可见菌体呈蓝紫色，单个、成对、短链状或者不规则排列聚集呈葡萄串状分布的革兰氏阳性球菌(图 2B)。

图2 分离菌在胶体几丁质培养基平板(A)和显微镜(B)下的形态Fig.2 Morphology of isolated bacteria on colloidal chitin medium plate(A) and under oil microscope(B)

2.2 分离菌株遗传距离分析及系统进化树的构建

9个分离菌株16S rDNA扩增产物测序所得的核苷酸序列，与NCBI上登录的不同来源8株沃氏葡萄球菌的遗传距离最小，范围在0～0.001(图3)。利用MEGA 7.0软件构建Neighbour-Joining进化树，结果显示，1～9株分离菌株与8株沃氏葡萄球菌的亲缘关系最近，位于同一个小分支上(图4)。因此，9株分离菌均应为沃氏葡萄球菌。

图3 分离菌株遗传距离分析结果Fig.3 Results of genetic distance analysis on isolated bacteria1～9是本研究的分离菌株，其它12株是NCBI上登录的不同来源的葡萄球菌

图4 分离菌株系统进化树的构建Fig.4 Construction of phylogenetic tree of isolated bacteria

2.3 分离菌株致病性试验结果

在致病性试验过程中，试验组盔形溞幼溞接种分离菌株菌液4 d后，3个平行试验组分别有80%、80%、60%的盔形溞出现壳刺断裂的症状(图5)。用胶体几丁质培养基平板对试验组断裂壳刺进行细菌菌株分离，结果也分离培养出湿润、表面光滑、隆起的乳白色圆形小菌落，呈革兰氏染色阳性球菌，在显微油镜下菌体特征与鳙鱼水培养引起的盔形溞断裂壳刺中分离到的菌株一致。对照组盔形溞，未能从其壳刺中分离到该细菌。

图5 沃氏葡萄球菌侵染盔形溞后壳刺的变化Fig.5 Changes of the tail spine of D.galeata infected by S.warneriA是分离菌株引发的盔形溞壳刺断裂现象，B是A的放大图

2.3 致病性试验后盔形溞断裂壳刺中分离菌的鉴定

将致病性试验后盔形溞断裂壳刺中得到的10～13株分离菌16S rDNA测序结果，在NCBI里进行BLAST，用MEGA 7.0软件构建Neighbour-Joining进化树，结果显示，10～13株分离菌株与1～9株分离菌和沃氏葡萄球菌的亲缘关系最近，位于同一个小分支上(图6)。因此，10～13株分离菌也均为沃氏葡萄球菌。

图6 致病试验后盔形溞断裂壳刺中分离菌株系统进化树的构建Fig.6 Phylogenetic tree construction of isolated bacteria from broken tail spines of D.galeata after pathogenic test10～13株是致病性试验后断裂壳刺中的分离菌

3 讨论

本研究结果表明，鳙鱼培养水引起盔形溞壳刺断裂的主要原因是由沃氏葡萄球菌致病造成的。该菌也曾在罗非鱼()、虹鳟()和黄带拟鲹()等多种鱼类中被发现，被认为是鱼类病害的潜在病原。本研究从盔形溞断裂壳刺中分离鉴定出沃氏葡萄球菌，该菌是否与鳙鱼生活环境或者鳙鱼自身的生理需求有关，目前尚不清楚。此外，沃氏葡萄球菌侵染盔形溞的致病部位是否只位于壳刺，还有待于进一步研究。

几丁质普遍存在于陆地和水生生态系统中，是一种十分丰富的有机大分子多聚物。几丁质的降解过程需要有几丁质酶的参与。目前，变形菌门中的粘质沙雷氏菌()、假交替单胞菌(sp)和纤维弧菌()，放线菌门中的链霉菌(sp)等多种几丁质降解菌已相继被发现。此外，在厚壁菌门的蜡样芽胞杆菌()、枯草芽胞杆菌()、苏云金芽胞杆菌()、类芽胞杆菌()和沃氏葡萄球菌()等种类中发现了几丁质酶的存在。ITOH等认为，产生几丁质酶的细菌一般能够参与几丁质的降解。在甲壳动物的外壳中，几丁质是广泛存在的，且在这些动物的生长过程中须完成新旧外骨骼的更替。在全基因组测序结果中，SAMRITI等发现了沃氏葡萄球菌中几丁质酶的存在。先前的研究已经表明，利用胶体几丁质培养基能够筛选出产生几丁质酶的菌株。本研究中，沃氏葡萄球菌在几丁质培养基平板上长出了乳白色菌落，这暗示沃氏葡萄球菌能够产生几丁质酶、且产生的几丁质酶水解了培养基中的几丁质。当沃氏葡萄球菌再次侵染健康的盔形溞后，会产生和鳙鱼培养水引起盔形溞壳刺断裂的相同性状。因此，我们认为这可能是沃氏葡萄球菌产生的几丁质酶对盔形溞壳刺中的几丁质有水解作用。由于盔形溞壳刺部位含有较多的几丁质，这可能是盔形溞壳刺部位易受到沃氏葡萄球菌侵染致病的原因。

根据科赫法则，沃氏葡萄球菌是造成本研究中盔形溞壳刺断裂的重要原因，但也不能排除盔形溞个体遇到潜在威胁时通过调节外部形态特征和内部生理功能等来适应异质生境而产生形态上的变化。因此，我们认为有必要深入开展沃氏葡萄球菌侵染盔形溞的机制及可能产生的病害等方面的研究，以提高人们对沃氏葡萄球菌侵染水生甲壳类动物表层几丁质的认识。