茎瘤芥甬榨2号小孢子发育时期与花器官形态的相关性分析

王 洁 孟秋峰 周洁萍 任锡亮 高天一 安学君

（1 宁波市农业科学研究院，浙江宁波 315040；2 浙江省余姚市小曹娥镇人民政府，浙江余姚 315475）

茎瘤芥（var.Tsen et Lee）是起源于我国的十字花科芸薹属芥菜种作物，俗名榨菜，富含人体所需的多种营养物质，加工后可作为下饭菜及休闲小菜食用，深受广大消费者欢迎。茎瘤芥在我国长江中下游地区和四川等地广泛种植，地方特色优势明显，推动其产业持续稳定发展，对提高冬闲田和冬季劳动力利用率，推行低碳农业，促进农业增效、农民增收和农业经济发展具有重大意义。

目前，我国茎瘤芥育种以杂交育种为主，采用传统多代自交纯化的方法获得纯合自交系一般需要6～8 代，甚至更长的时间，费时、费工、费力。游离小孢子培养技术是近年来发展较为成熟的单倍体育种技术，可以简化自交系的纯合过程，缩短育种年限，提高育种效率（石江鹏 等，2017）。大量研究表明，选材是游离小孢子培养能否成功的决定性因素（申娟 等，2008）。沈进娟等（2012）研究表明，处在单核靠边期和双核初期的茎瘤芥小孢子成胚率较高。通过细胞学及显微镜观察等方式确定小孢子的发育时期较为精确，但是操作繁琐、耗时耗力。前人在叶用芥菜、菜薹（菜心）、普通白菜（小白菜）等十字花科作物上的研究表明，小孢子的不同发育时期与花器官外部形态存在显著相关性（吴康云 等，2012；庞强强 等，2019；杨延红 等，2020）。但关于茎瘤芥小孢子发育时期与花器官外部形态的相关性研究未见报道。本试验选择长江中下游地区广泛种植的甬榨2 号为试材，通过对其小孢子不同发育时期的花器官外部形态及相关指标进行观察、测定，研究茎瘤芥小孢子不同发育时期与花器官外部形态的相关性，以期简化田间取材方法，快速精准取材，为茎瘤芥游离小孢子培养在育种上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茎瘤芥品种为宁波市农业科学研究院选育的甬榨2 号，2020 年10 月上旬播种育苗，11 月上旬定植在宁波市农业科学研究院高新农业试验园区，小区面积5 m，3 次重复，株距20 cm，行距25 cm，每小区种植150 株，常规田间管理。2021 年5 月，于植株盛花期选择晴天的上午进行取材。

1.2 花蕾形态观察及相关指标测定

参照杨延红等（2020）的方法，每小区随机选取新鲜花序3 个，观察不同发育时期花蕾的大小、饱满程度、颜色等。在解剖镜下用镊子和解剖针去除花萼，小心剥开花瓣，取出花药，观察记录花瓣和花药颜色；使用游标卡尺测量花蕾、花瓣、花药的纵径和横径。

1.3 小孢子细胞核观察

利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染料对小孢子细胞核进行染色，在正置荧光显微镜（DMLB，Leica，Germany）下观察拍照。

1.4 花药半薄切片观察

参照王洁（2015）的方法进行包埋处理及切片，使用1%亚甲基兰染色后在正置荧光显微镜下观察拍照。

1.5 小孢子超微结构观察

参照王洁（2015）的方法进行超薄切片处理，使用醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液和柠檬酸铅溶液各染色15 min，干燥后于Hitachi ModelH-7650型透射电镜下观察拍照。

1.6 数据处理

采用Excel 软件对试验数据进行统计、分析，利用SPSS 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 甬榨2 号小孢子不同发育时期的细胞学及超微结构特征

通过对不同发育时期茎瘤芥甬榨2 号小孢子的形态进行观察，并结合半薄切片以及超微结构观察发现（图1～3、表1），小孢子母细胞时期，细胞表面被一层厚厚的胼胝质包裹，有1 个细胞核，细胞形状不规则，细胞质内有丰富的细胞器和小液泡，内部分化程度较低；四分体时期，小孢子的外部为四裂状，由4 个细胞组成联合体，外面被一层胼胝质包裹，经染色后可以看到4 个细胞核同时出现在同一个联合体里，小孢子内有较多的片层膜结构，如多聚核糖体，线粒体体积较小；随后，四分体外面的胼胝质壁水解，体积较小的单个小孢子被释放出来，逐渐发育成圆形或近圆形，细胞质内含有许多小液泡和质体，质体体积较小，花粉外壁开始发育并逐渐变厚，此时细胞内只有1 个细胞核，细胞核较大且位于细胞中央，即单核早中期；随着发育进程的推进，细胞体积不断增大，形状呈圆形，细胞内的小液泡逐渐融合，形成大液泡，萌发沟逐渐形成，细胞质浓厚，有丰富的细胞器，线粒体体积较大，细胞核靠近细胞的边缘，因此称为单核靠边期，也称单核后期；之后，单核小孢子进行第1次有丝分裂，由于是不均等分裂，因此形成1 个体积较大、靠近液泡的营养核和1 个体积较小、贴近细胞壁的生殖核，花粉内壁形成，质体较多，即双核时期；最后，生殖核分裂为2 个精子，此时小孢子细胞内可看到3 个核，即1 个营养核和2 个精核，细胞质内有淀粉粒和脂滴分布，电子密度较高，花粉外壁形成电子密度较高的3 层结构，最外层为覆盖层，中间为基粒棒层，底部为基足层，为三核时期。

图1 甬榨2 号小孢子不同发育时期细胞核染色观察结果

图2 甬榨2 号小孢子不同发育时期花药半薄切片观察结果

图3 甬榨2 号小孢子不同发育时期超微结构观察结果

表1 甬榨2 号小孢子不同发育时期的细胞学形态特征

2.2 甬榨2 号小孢子不同发育时期与花器官形态特征的相关性

对茎瘤芥甬榨2 号小孢子不同发育时期的花器官外部形态进行观察发现（图4、表2），小孢子母细胞时期，花蕾很小，花萼完全包裹着花药，花萼和花瓣颜色均为浅绿色，花药绿色；四分体时期，花蕾较小，花萼仍然完全包裹着花药，花萼和花瓣颜色均为绿色，花药淡黄绿色；单核早中期，花蕾稍大，完全闭合，花萼包被着花药，花萼绿色，花瓣和花药均呈现黄绿色；单核后期，花蕾逐渐膨大，仍完全闭合，花萼包被着花药，花萼绿色，花瓣淡黄色，花药黄绿色；双核时期，花蕾明显膨大，花萼未张开，颜色为绿色，花药比花瓣短，颜色为黄绿色，花瓣淡黄色；三核时期，花蕾表现为细长、蓬松的形态，花萼未张开，颜色为黄绿色，花瓣明显长于花药，未露出萼片或部分露出，花瓣和花药颜色均为黄色，花萼黄绿色。由此可以通过观察花蕾的外观形态，花药和花瓣的颜色，以及花瓣、花药长度等，快速将处于单核后期和双核时期的花蕾区分开来。

图4 甬榨2 号小孢子不同发育时期的花蕾形态变化

表2 甬榨2 号小孢子不同发育时期的花器官外部形态特征

甬榨2 号小孢子不同发育时期的花器官形态指标测定结果见表3。进一步计算8 个指标的平均值，进行差异显著性分析。结果表明（表4），甬榨2号的花蕾纵径、花蕾横径、花药纵径、花药横径、花瓣纵径均随着小孢子发育进程的推进呈现逐渐增长的趋势，其中花蕾纵径和花蕾横径在各个发育时期均表现出显著性差异，可以根据这2 个指标实现小孢子发育时期的快速甄别。例如，小孢子单核后期的花蕾纵径范围在3.50～3.79 mm 之间，横径在1.92～2.21 mm 之间。此外，单核后期的花药纵径与其他发育时期也存在显著性差异，亦可以依据该指标将单核后期的小孢子与其他时期进行区分。

表3 甬榨2 号小孢子不同发育时期的花器官外部形态指标

表4 差异显著性分析结果

3 讨论与结论

植物小孢子的发生经历了小孢子母细胞时期、四分体时期、单个释放的小孢子时期，单个释放的小孢子时期又经历了单核早期、单核中期、单核后期（也称单核靠边期）、双核时期及成熟时期（McCormick，1993）。大部分植物成熟时期的花粉为二核花粉，即成熟的花粉粒中含有1 个较小的生殖核和1 个较大的营养核。少数植物，如十字花科作物，随着双核花粉的不断发育，生殖细胞还要再进行一次有丝分裂，随即形成含有2 个生殖核和1 个营养核的三核细胞。本试验中，通过DAPI 染色发现茎瘤芥甬榨2 号的成熟花粉粒中含有3 个细胞核，属于三核花粉，这与萝卜、普通白菜（小白菜）等十字花科作物上的研究结果一致（李丹 等，2008；杨延红 等，2020）。

游离小孢子培养受多种因素的影响，选择合适生长时期的材料是小孢子能否诱导成功的决定性因素。研究表明，大多数作物处在单核时期的小孢子在适宜培养条件下容易被诱导发育成胚（庞强强 等，2019）。沈进娟等（2012）研究发现，茎瘤芥单核后期和双核初期的小孢子成胚率较高。通过细胞学观察可以确定小孢子的发育时期，但在实际操作中因工作量巨大，一般不会对每个小孢子的发育时期进行检测。前人研究表明，小孢子发育时期与花器官的外部形态之间存在一定的相关性（李丹等，2008；庞强强 等，2019；杨延红 等，2020）。本试验通过观察甬榨2 号小孢子不同发育时期花蕾、花药等花器官形态特征发现，处在单核后期和双核时期的花蕾饱满，花瓣淡黄色，花药黄绿色，与其他几个时期相比特征明显，能够很容易将二者与其他时期区分开来；而双核时期的花瓣长于花药，又可快速将这二者区分开。由于单核后期和双核时期的花蕾还处于闭合状态，实际操作中可用镊子小心将花萼和花瓣拨开，以便观察。进一步对甬榨2 号小孢子不同发育时期的花蕾纵径、横径、纵横比，花药纵径、横径、纵横比，花瓣纵径及瓣药比等8 项指标进行统计学分析，花蕾纵径和花蕾横径在各个发育时期均存在显著性差异，可以作为该品种区分小孢子不同发育时期的花器官形态指标。除此之外，单核后期的花药纵径与其他发育时期也存在显著性差异，亦可以依据该指标将单核后期的小孢子与其他时期进行区分。但是就实际操作的可行性而言，进行小孢子培养时建议采用直接测量花蕾纵径实现田间的精准取材既经济快捷又方便准确，可以大幅提高小孢子培养的效率。这与甘蓝类、白菜类等十字花科作物开展小孢子培养时一般以花蕾长度作为参照确定小孢子培养时期的结论一致。然而，本试验中处在单核后期的花蕾纵径范围为3.50～3.79 mm，与沈进娟等（2012）、杨明贵等（2015）在其他茎瘤芥品种上得到的数值均存在一定差异，这可能是由于芥菜类蔬菜类型丰富，不同品种之间花蕾长度差异较大。今后应对不同生态类型、不同地区的大量多样化茎瘤芥品种进行测定分析，最终确定田间快速、精准取材的标准。