固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定飞燕草中7种生物碱

樊轻亚， 许卫军

(信阳职业技术学院药学院，河南信阳 464000)

飞燕草(Consolidaajacis(L.) Schur)为毛茛科飞燕草属草本植物，又名百部草、鱼灯苏。在我国山西、江西、广西、陕西、浙江、河南、福建等地均有生长，全草可供药用，具有祛风、理湿、止痛、止咳化痰等功效，《植物名实图考》、《中华本草》、《中国药植图鉴》、《浙江天目山植志》等均有记载。飞燕草植物中主要有效成分是生物碱类物质，约占1%，具有抗菌、肌松及解痉作用等[1]。张伟等研究发现飞燕草总碱是一种竞争性肌肉松弛剂，对兔、犬的横纹肌肉有明显的松弛作用，可用于多动症、肌紧张等疾病[2]。

生物碱的分离纯化方法多为液-液萃取和固液萃取等方法，但这些传统的方法具有操作过程繁琐、有机溶剂用量大、残留多、经济成本比较高、对环境有一定的污染等缺点。而固相萃取法操作简单，无两相分离的繁琐操作；萃取时间短，选择性高，能萃取小体积待测样品且不改变样品生物活性；富集倍数高且有较高的回收率；有机溶剂消耗少、残留低，环境污染小，符合绿色化学的概念，在食品、医药化工等农药残留及痕量检测等领域得到了越来越广泛的应用[3 - 9]。目前，固相萃取用于中草药有效成分分离纯化方面的研究也有一些报道[10 - 13]，但在药用飞燕草的萃取分离等方面尚未见相关的报道。

超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)与传统HPLC法相比，具有速度快、灵敏度高、分离效果好等优点，在食品、医药等领域具有广泛的应用[14 - 18]。本实验采用PCX固相萃取小柱净化样品中生物碱成分，并与UPLC-MS/MS联用测定飞燕草中7种生物碱的含量。该方法简单快速、净化效果好、选择性好、灵敏度和精密度高，可快速检测飞燕草中7种生物碱的含量，为飞燕草的进一步研究和开发提供科学依据，具有一定的实用价值。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

美国Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源。

洋翠雀碱、翠雀索灵碱、洋翠雀枯生碱、巴比翠雀碱、洋翠雀定碱、洋翠雀康宁、翠雀胺标准品(成都普菲德，纯度>98%)；固相萃取柱：C18柱(Waters，500 mg/3mL)，HLB柱(Waters，200 mg/6mL)，PCX柱(上海楚定分析仪器，60 mg/3mL)，SCX柱(上海楚定分析仪器，60 mg/3mL)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克)。实验用水为超纯水。

实验用飞燕草药材均购于网络药材市场，经鉴定为飞燕草(Consolidaajacis(L.) Schur)全草。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取实验称取一定量的100目飞燕草粉末于提取容器中，按照1∶60的料液比加入乙醇提取60 min，提取液在60 ℃下挥干后，用甲醇定容至5 mL，用稀HCl调节pH值为6，备用。

1.2.2 固相萃取依次用5 mL甲醇、5 mL水润洗PCX固相萃取小柱，随后取上述浓缩液至柱上，流速为1.0 mL/min，待样品流干之再后加入5 mL水进行淋洗，然后抽真空吹干，用5 mL的3%氨水甲醇溶液洗脱PCX小柱，收集洗脱液，N2吹浓缩至干，用UPLC流动相进行溶解，用UPLC-MS/MS法测定。

1.2.3 对照品溶液的制备精密称取7种对照品(洋翠雀碱、翠雀索灵碱、洋翠雀枯生碱、巴比翠雀碱、洋翠雀定碱、洋翠雀康宁、翠雀胺)各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的储备溶液。然后精密吸取7种储备溶液各1 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得0.1mg/mL的混合对照品溶液。

1.3 样品分析条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BHE C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm，美国Waters公司)；流动相：乙腈(A)-0.2% NH4Ac(B)，梯度洗脱程序:0～2 min，2%～15%A；2～8 min，15%～50%A；8～12 min，50%～80%A；12～15 min，80%～2%A；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：3 μL。

1.3.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式；离子源温度：130 ℃；干燥气温度：350 ℃；干燥气(N2)流速：9.0 L/min；毛细管电压：3.0 kV；锥孔气流量：50 L/h；碰撞气流量：2.5 L/h。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

提取溶剂的选择既取决于被提取物质的性质，还和物质的介电性质与溶剂的差异性有关。本实验分别以乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、乙醇和正戊烷作为溶剂，以7种生物碱作为提取目标物，研究了不同溶剂对提取率的影响，结果见图1。

图1 不同溶剂对生物碱提取率的影响Fig.1 Effect of different solvents on the extraction efficiency of alkaloids

实验结果表明，在非极性溶剂正戊烷中检测不到7种生物碱组分，而在极性稍弱的溶剂乙酸乙酯和三氯甲烷中则提取效果较差，提取后其它杂质成分较多，后续操作的干扰问题较多。在极性较强的溶剂甲醇、乙醇中7种生物碱的提取率较高，这是因为飞燕草生物碱中含有叔胺氮和羟基，这些基团都具有一定的极性，因此选择极性较强的溶剂有利于这些组分的溶解和释放。乙醇和甲醇的提取率相差不大，但是乙醇无毒，并且价格便宜，因此本实验选择乙醇作为提取溶剂。

2.2 固相萃取体系的筛选及萃取条件的优化

2.2.1 固相萃取柱的选择飞燕草成分复杂，不仅含有生物碱，还含有固定油、脂类、苷类等多种物质。这些成分不仅会干扰待测物质的分析测定，而且会对检测仪器和色谱柱造成一定的损害。因此本文分别考察了C18柱、PCX柱、SCX柱、HLB柱等4种固相萃取柱对于飞燕草中生物碱类化合物的前处理净化能力。以回收率作为评价的指标，实验结果见图2。由图2可知，选用C18柱及HBL柱时，各种生物碱的回收率较低，且洗脱液难以浓缩。这是因为以硅胶键合的C18小柱和聚合物基质的HLB小柱都是非极性反相萃取吸附小柱，其主要用来吸附提取物中的非极性目标物，极性越大的物质则在柱上被吸附的越少，所以对具有一定极性的7种生物碱的回收率偏低；选用SCX柱时，7种生物碱成分回收率大概在50%～70%；选用PCX柱时，7种物质的回收率均能达到80%以上，且萃取速度较快。PCX柱萃取回收率比SCX柱高，因此本文采用PCX固相萃取柱进行样品前处理。

图2 4种固相萃取柱的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of 4 kinds of SPE cartridges for alkaloids

2.2.2 洗脱溶剂的选择及优化在SPE中洗脱是关键步骤，本实验分别以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇、3%的氨水甲醇作为洗脱溶剂，研究其对7种生物碱回收率的影响。实验结果显示：乙醚的洗脱液中无生物碱成分，可能是因为乙醚的极性过低，对几种生物碱的洗脱不利；乙酸乙酯和正丁醇洗脱液中仅含有少数生物碱成分，且回收率较低；在乙醇和甲醇洗脱液中，均含有7种生物碱成分，但乙醇洗脱液中还含有较多杂质，甲醇洗脱后回收率较高。在甲醇中加入一定比例的氨水进行洗脱，结果显示含有3%氨水的甲醇比纯甲醇的洗脱能力更强，这是由于生物碱在植物细胞中大部分以盐的形态存在，加入氨水使得生物碱游离为分子状态，有利于溶解于有机溶剂中，大部分生物碱成分的回收率都能达到较高水平。实验选择3%氨水甲醇溶液为洗脱溶剂。

2.2.3 上样液pH值对固相萃取的影响本实验通过在提取液中加稀HCl或稀氨水调节pH值为5～10，考察pH对萃取率的影响。由图3可知，pH为6时，萃取率最大，这与生物碱类物质在不同pH下存在的分子结构的类型有关。由于飞燕草中7种生物碱成分均含有叔胺N，为弱碱性化合物，在酸性条件下，弱碱性物质易电离成离子状态；当pH值为6时，生物碱完全电离，吸附剂分子之间的相互作用力增大，其在PCX固相萃取柱中的保留增强，有利于杂质的分离。而当萃取物pH增大至碱性时，目标物质不能完全电离，也不能被吸附剂吸附保留，因此选择稀HCl调节pH值为6比较合适。

图3 pH值对萃取率的影响Fig.3 Effect of pH on extraction efficiency1.Delosine;2.Delconsine;3.Ajadine;4.Eldeline;5.Ajaconine;6.Ajacusine;7.Ajacine.

2.3 色谱-质谱条件的优化

2.3.1 色谱条件的选择对飞燕草固相萃取后提取液进行UPLC-MS/MS分析，考察了有机相溶剂(乙腈、甲醇)中加入不同种类的缓冲液(三乙胺、乙酸铵、氨水等)作为流动相时，对待测物的分离效果和对质谱电离的影响。实验发现，采用乙腈作为色谱分析的流动相时，分离度更好，且能使色谱的分析时间明显缩短。在有机相中添加一定比例的NH4Ac可以使质谱电离过程的离子化程度更高，质谱响应更强，色谱峰的峰形更好。因此，以乙腈-0.2%NH4Ac溶液为流动相，选择梯度洗脱方式，7种生物碱分离度良好，峰形好、柱效高。实验所得总离子流色谱图见图4。

图4 飞燕草固相萃取后总离子流(TIC)色谱图Fig.4 TIC of Consolida ajacis(L.) Schur after SPE 1.Ajacusine；2.Ajacine；3.Ajaconine；4.Delcosine； 5.Delsoline;6.Eldeline；7.Ajadine.

2.3.2 质谱条件的优化和裂解途径采集全扫描模式下正离子、负离子信号，实验结果显示负离子模式下几乎无质谱响应，因此选择响应良好的ESI+作为离子化模式，分别找出这7种化合物的[M+H]+，作为准分子离子峰。母离子需要进行碰撞诱导才能产生子离子，进一步优化质谱参数中的干燥气体、干燥器流量、碰撞电压和锥孔电压等，选择两个响应较强的子离子作为监测碎片离子，选择响应值最大的子离子进行定量分析。7种化合物的质谱数据见表1。

表1 7种生物碱的质谱参数

在ESI+条件下，7种化合物主要发生侧链断裂，根据二级质谱数据，可以推测7种化合物的裂解路径。除洋翠雀康宁外，其它6种生物碱母核结构相同，这6种生物碱有一个共同质谱断裂特征，即16位脱甲氧基断裂；另外翠雀胺、翠雀索灵碱发生1位羟基的断裂，在二级质谱图中可以观察到很强的[M+H-18]+特征碎片离子；洋翠雀枯生碱、洋翠雀碱和洋翠雀定碱发生4位酯基的断裂；巴比翠雀碱发生6位的脱羧反应；洋翠雀康宁发生羟乙基断裂和脱水反应。7种化合物质谱裂解路径见图5。

图5 7种生物碱的二级质谱图和质谱裂解途径Fig.5 Fragmentation pathways of 7 alkaloids compounds

2.4 线性范围、检出限与定量限

分别取一定量的7种生物碱标准溶液，配制成1、5、10、20、40、80、100 mg/L标准系列溶液，按UPLC-MS/MS测定条件进行测定，根据检测时得到的色谱峰面积和浓度之间的关系绘制相应的标准曲线。以信噪比(S/N)=3及S/N=10计算该方法的检出限和定量限。由表2可知，7种飞燕草生物碱的线性范围均在1～100 mg/L之间，相关系数均在0.982以上，7种生物碱的检出限为0.02～0.45 mg/L，方法定量限为0.08～1.23 mg/L，表明该方法灵敏度良好。

2.5 回收率与精密度

分别准确称取3份样品，分别添加1、5、10 mg/L三个浓度水平的7种生物碱的混合对照品溶液，采用“1.2.1”及“1.2.2”方法进行提取和萃取，按实验方法进行了回收率及精密度实验，结果见表2。7种生物碱的加标回收率在95.9%～98.1%之间，相对标准偏差(RSD)在1.4～2.5%之间，表明所建立的分析方法准确、可靠，回收率高，精密度良好。

表2 7种生物碱的回归方程、线性范围、检出限、定量限及回收率(n=6)

2.6 实际样品的检测

精密称取6个产地飞燕草药材粉末各20 g，按照“1.2.1”和“1.2.2”方法提取及萃取后，然后按1.3方法测定其含量，结果见表3。由表3可知，6个产地中均检测出7种生物碱成分，但6个产地的飞燕草中各种生物碱含量分布不同，翠雀索灵碱含量最高，洋翠雀康宁、洋翠雀枯生碱在各个产地中含量相差较大；广西产地的7种生物碱含量明显高于其它产地，而江西产地的7种生物碱成分均低于其他省份，这些含量和分布的差别可能和该植物生长时所需的温度与地质条件有关。因此在提取飞燕草中生物碱时，应根据其组成和含量分布进行产地筛选，以利于获得更高的提取率，降低生产成本。

表3 6个产地飞燕草药材中7种生物碱的分析结果(n=6)

3 结论

本文将固相萃取技术应用于飞燕草中生物碱的萃取，采用单因素实验方法优化了固相萃取中各因素对飞燕草中7种生物碱萃取率的影响，并与超高效液相色谱-串联质谱法联用测定生物碱含量。该固相萃取法操作简单，萃取时间短，选择性高，富集性及回收率都较高，是一种具有极大发展前景的萃取技术。本文中超高效液相串联质谱法在保证含量测定准确的前提下，可提高分析效率，降低分析成本，凸显现代环保的理念，对后继药物活性关系和品质的开发利用具有重要的研究价值。