黄芩苷纳米水凝胶对大鼠实验性牙周炎的影响

朱文婷 邹 茵 李晓丹 徐贤寅

牙周炎是一种由牙周致病微生物引起的慢性炎症和病变,其特征是牙周炎症和进行性牙槽骨破坏。通常通过洁治或刮治来消除致病因素，而局部治疗使用化学药物治疗无法在牙周带深处进行洁治或刮治。大多数化学治疗剂都是化学合成的抗菌类冲洗剂，含漱剂和凝胶类抗菌剂。长期全身和局部应用抗生素会导致机体细菌群落失衡，同时产生耐药性，不能促进牙槽骨的再生。

中药或天然物质治疗牙周炎是近年来的研究重点之一。随着中药现代化发展，越来越多具有抗炎作用的化合物从中草药中分离提取出来，这表明具有潜在的药理学作用。黄芩苷是黄芩的干燥根茎中提取出来的一种黄酮类化合物，因其具有显著的生物活性，在临床上广泛用于抗炎、抑菌、抗肿瘤和心脑血管疾病的治疗。临床研究发现，局部使用黄芩苷可以减少牙周袋的深度，改善牙龈出血，减少牙周炎症。然而黄芩苷是一种几乎不溶于水的黄色结晶，作为药物生物利用度低。随着生物材料学的迅速发展，越来越多的生物材料作为新型药物载体应用于药物研究中。纳米载体药物能深入病变部位，并以预定的速度释放，从而改善治疗效果，减少不良反应。因此研究者开发了一系列药物载体，如核鞘结构纤维和粒子、多层结构纳米纤维膜、粒子包覆纤维或水凝胶等，与传统药物比较，可以有效地利用不溶性药物。本研究采用乳化-蒸发法制备黄芩苷纳米水凝胶，通过考察其药物特性，并通过构建大鼠实验性牙周炎以研究黄芩苷纳米水凝胶对大鼠实验性牙周炎的保护作用。

材料与方法

1.实验材料:Wistar大鼠[SCXK(京)2016-0011]购自维通利华实验动物技术有限公司；黄芩苷购自上海阿拉丁生物科技有限公司；胆固醇(cholesterol)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；二油酰基卵磷脂(1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司；壳聚糖溶液(相对分子质量=50000)购自青岛海普生物技术有限公司；IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α ELISA 试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司；十六烷基季铵化羧甲基壳聚糖(hqcmc)由本单位实验室自制；其他化学试剂均为分析纯购自国药集团。本研究使用 savant modulyo 冷冻干燥机购自美国Varian公司;电子天平购自德国Sartorius公司;纳米粒度分析仪(nanozs90 zetasizer)购自英国Malvern公司；扫描电子显微镜购自日本HITACHI公司；紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher公司；离心机5415d购自德国Eppendorf公司;微量移液器购自德国Eppendorf公司;移液枪头和离心管等实验耗材均购自美国Axygen公司。

2.黄芩苷载药纳米水凝胶制备：采用乳化-挥发法制备黄芩苷纳米粒。将8mg黄芩苷和20mg 的mPEG-PCL载体溶于1ml 氯仿作为有机相。将上述有机相滴入3ml 5%的聚乙烯醇溶液中进行超声乳化(17.5W，30s)，得到的o/w乳状液进一步分散在含有1%聚乙烯醇的8ml溶液中，室温搅拌2h，得到的液体用慢滤纸过滤除去可能的黄芩苷沉淀。将上述液体按3% 的比例加入甘露醇中，冷冻干燥72h，在4℃阴暗条件下贮存。无载药空白纳米粒的制备方法与上述方法相同，但有机相中未加入黄芩苷。以壳聚糖衍生物和二烯基磷脂为支架，合成了黄芩苷纳米球，并将其均匀分散于水溶液中，制成凝胶。

3.黄芩苷纳米水凝胶的研究:采用粒度分析仪测定黄芩苷纳米微球凝胶的粒径和和电位。采用扫描电子显微镜(SEM)观察药物在PBS缓冲溶液中的形态结构，并测定不同pH值下药物在一系列作用次数下的释放速率。

4.大鼠实验性牙周炎模型的建立及分组：选取30只SPF级牙体牙列完整、无龋坏及牙周异常的5周龄雄性Wistar大鼠，随后把动物随机分为5组(每组6只)，即正常组、模型组(牙周炎对照组)、对照组(空白纳米水凝胶)、阳性对照组(洗必泰)和实验组(黄芩苷纳米水凝胶)。采用0.2mm正畸钢丝结扎双侧上颌第二磨牙颈部，结扎后给予10%的糖水代替饮水，前3天每只大鼠每天喂食20mg氨苄青霉素，以抑制普氏菌和核梭杆菌内源性细菌的有害物质。每只大鼠每天注射0.5ml 1.0×10CFU/ml 普氏菌+0.5ml 1.0×10CFU/ml 梭状芽胞杆菌核酸，连续给药3天。模型组大鼠喂饲饲料和水，不加干预。实验组给予黄芩苷纳米水凝胶，对照组给予空白纳米水凝胶，阳性对照组在实验第1周每2天给予0.5ml 洗必泰，随后每天1次，连续3周。

5.观察其抗炎、抑菌作用:第4周观察牙龈炎症和牙周袋深度。采用1967年修订的Loe与Silness检测方法检测牙龈指数:0表示健康牙龈组织，1、2、3分别表示轻度、中度和重度白色牙龈炎症。用灭菌镊子将灭菌纸尖插入牙周袋，采集左上颌第二磨牙龈下菌斑，放置约20s后，将纸尖插入含1ml无菌PBS的EP管内，涂于相应的平板上，计数作为病原菌的定植试验。采用添加氨苄青霉素(12g/ml)和5%绵羊血的BHI固体培养基计数大鼠口腔内的梭杆菌核普菌和梭杆菌数量。

6.牙周组织学检查：采用柠檬酸甲酸钠脱钙液对大鼠固定牙周组织(包括牙齿)进行脱钙处理2个月。标本用石蜡包埋，切成5μm厚的切片进行HE染色。光镜下观察大鼠牙周组织切片，观察牙周组织的破坏情况。

7.酶联免疫吸附试验:在10μg/ml 不含乙二胺四乙酸 (EDTA) 的蛋白酶抑制剂混合物 (Thermo Scientific) 存在下，使用玻璃匀浆器在补充有 0.05%吐温20(TWEEN-20)的PBS中匀浆牙龈组织。匀浆组织的悬浮液以 1500r/m 离心，收集上清液。根据酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒在收集的上清液中测量IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白的浓度。

结 果

1.黄芩苷纳米球凝胶的粒径和形态:纳米粒度分析仪检测结果显示，黄芩苷纳米球凝胶粒径分布为100～1000nm，平均为577.0nm，分散指数PDI为0.81(图1A)，ZETA电位平均值为46.3mV(图1B)，SEM显示黄芩苷纳米球凝胶为光滑的胶束，大小约为500nm (图1C)。

2.黄芩苷纳米球凝胶在不同pH值溶液中的释药速率:根据黄芩苷在278nm 处的紫外吸收峰，测定了黄芩苷的标准曲线，并测定了样品中游离黄芩苷的含量(图2A)。根据黄芩苷的外加质量，计算黄芩苷纳米球凝胶包埋黄芩苷的含量、包埋率和载药量详见表1。药物在0.03mol/L PBS (pH=7.4)缓冲液中的释放速率分别为2、4、6、8、10、12、14、24、36、48、60、72、84、96和120h。黄芩苷在6h内的释放率为73.67%，黄芩苷纳米球凝胶的释放率为36.03%(图2B)。结果表明，黄芩苷纳米球凝胶具有良好的缓释特性，不会突然释放。

3.抑菌作用:干预4周后，所有大鼠模型均出现轻度牙龈炎症，3组间牙龈指数比较，差异无统计学意义。模型组牙周袋深度为0.79±0.29mm，对照组为0.75±0.32mm，阳性对照组为0.84±0.22mm，实验组为0.64±0.17mm。实验组与模型组比较，差异有统计学意义(=-0.613，<0.05)，而实验组与阳性对照组比较，差异无统计学意义。干预后第2周和第4周大鼠核梭杆菌和普氏菌细胞计数发生变化。干预4周后，模型组与对照组以及阳性对照组比较，差异无统计学意义，实验组牙周病原菌明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义(<0.05,表2)。

4.牙周组织观察：干预4周后，模型组牙周组织与正常牙周组织比较，牙周骨高度降低，血管扩张充血，局部炎性细胞浸润。干预4周后，实验组和阳性对照组牙槽骨高度降低，牙周组织有轻度炎性细胞浸润。与模型组比较，实验组和阳性对照组的炎性反应程度较轻而对照组炎性反应变化不大(图3)。

5.黄芩苷纳米水凝胶对实验性牙周炎中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达影响：干预4周后，模型组牙周组织与正常牙周组织比较，牙周组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α显著升高。与模型组比较，对照组无明显变化，阳性对照组和实验组均显著降低；与阳性对照组比较，实验组炎性细胞因子水平也有显著降低。

讨 论

黄芩苷已经被证明具有多种生物学功能，如抗炎、抗氧化和抗菌的作用，由于其生物学功能，黄芩苷称为治疗牙周炎提供了一种非常有前景的药物。为了更好地利用其作用笔者使用了生物聚合物给药系统，从而提高其生物学功能。在选择合适的生物生物聚合物的前提下，笔者考虑了黄芩苷和所用材料之间的协调作用。壳聚糖是一种常见的生物材料载体，在口腔疾病治疗中发挥这重要作用。本研究笔者利用乳化-蒸发法制备黄芩苷纳米水凝胶，通过考察其药物特性，并通过构建大鼠实验性牙周炎以研究黄芩苷纳米水凝胶对大鼠实验性牙周炎的保护作用。

本研究中首先采用壳聚糖衍生物和二油酰基卵磷脂作为骨架材料制备成包载黄芩苷纳米球水凝胶，在解决其水溶性差的基础上使其能在局部用药达到缓释的效果，以增强疗效。改性后的壳聚糖在水介质中发生微相分离形成的具有疏水性内核与亲水性外壳的两亲性聚合物，可作为疏水药物的增溶载体,避免因反应引入表面活性剂, 同时能保护药物不被迅速降解,使得药物能缓慢释放,而亲水性外壳则有助于长时间保留在血液循环系统内。因此以壳聚糖衍生物和二油酰基卵磷脂构建纳米缓释微球水凝胶，提高了体系对疏水性药物黄芩苷的包封率，包封率可达95%以上，载药率为14.21%±0.25%，同时粒径较小约577.0nm，表面ZETA电位为+46.3mV，表面光滑，分散均匀，形状规则稳定。体外释放实验显示，药物缓释过程中突释较小，释放时间较长，释放时间可持续4天，可在一定程度上避免给药后药物吸收的不完全。

在动物实验中，将黄芩苷纳米球凝胶作用于大鼠实验性牙周炎模型第2周、第4周进行牙周检查。首先通过对牙周袋深度测量，实验组牙周袋深度小于模型组和对照组，与阳性对照组比较，差异有统计学意义(<0.05)，提示黄芩苷纳米球凝胶能抑制炎症对牙周组织的破坏；随后对牙周组织致病菌核梭杆菌和普氏菌细胞进行计数分析，发现黄芩苷纳米微球凝胶能有效的抑制牙周致病菌的发展。通过组织形态检查显示，黄芩苷水凝胶能显著改善牙周组织炎症。研究表明，黄芩苷通过抑制牙龈组织中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎介质的表达来减轻炎症，减少牙槽骨破坏，促进牙周结构的恢复，本研究结果与这一发现一致，并优于阳性对照组。因此，动物实验结果显示，黄芩苷纳米球凝胶生物利用度高，具有缓释的特性，能用做牙周炎的局部治疗药物。

综上所述，黄芩苷纳米球凝胶具有较高的载药量和缓释效果，能够改善牙龈炎症、牙周袋深度、微生物及牙周组织病变，这为凝胶治疗牙周疾病提供初步的实验依据，也证明黄芩苷纳米球凝胶具有良好的临床应用前景和价值。