基于CSE/H2S通路探讨葱白提取物干预大鼠动脉粥样硬化的作用及机制

雷 杰 段刚峰 董 莹 陈忠辉 夏 雯

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) 是一种慢性炎症性血管疾病，病变涉及大、中动脉，其特征在于血管脂质积累、炎症及免疫系统活化、氧化应激、内皮细胞活化、动脉平滑肌细胞增殖、巨噬细胞活化和泡沫细胞形成等导致内皮功能障碍。动脉粥样硬化相关炎症是由促炎性细胞因子、炎性信号通路和黏附分子介导。目前，胱硫醚γ裂解酶(cystathionine γ lyase，CSE)被证实可通过内源性合成硫化氢(hydrogen sulfide，HS)来减少血管内膜炎症和抑制黏附分子表达以发挥保护血管的作用，故CSE/HS途径是预防动脉粥样硬化的重要治疗靶标。

葱白提取物是从双子叶百合科植物分葱(allium fisturosum L var．eaespitosum makio)的近根部的鳞茎中提取的活性成分。前期实验发现，葱白提取物能调节大鼠血脂水平、抑制血管内膜脂质沉着、调节免疫、抑制炎性细胞因子分泌，发挥抗AS的作用。但葱白提取物抗AS的具体机制目前尚未完全清楚。为此，本实验建立大鼠动脉粥样硬化模型，用葱白提取物进行干预，观察、比较血脂、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)、基质金属蛋白酶(MMP7、MMP9)、CSE的水平，探讨葱白提取物抗AS的作用机制。

材料与方法

1.实验动物：健康纯种SD大鼠40只，3～4月龄，体质量为200±20g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证编号：HNASLKJ20100330。

2.实验药品：葱白提取物由双子叶百合科植物分葱的新鲜鳞茎经冷冻干燥和超临界CO萃取得到，干燥葱白超临界萃取的总得率在1.85%左右，相当于每54g干燥葱白粉可萃取得到1g葱白提取物，主要含有含硫化合物、甾体、皂苷、不饱和脂肪酸等化合物，浓度为25%。辛伐他汀(舒降之)片由杭州默沙东制药有限公司提供。

3.实验试剂：血脂检测试剂盒均购自长春汇力生物技术有限公司；ELISA Kit购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；Trizol购自美国Ambion公司(货号：15596-026)；RNase H、5×HiScript Buffer购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(货号:R101-01/02)；dNTP、Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA marker购自北京天根生化科技有限公司(货号分别为CD117、ET105-01、MD114-02)；Random Primer(N6)购自日本TaKaRa公司(货号:3801)；内参对照(GAPDH)购自杭州贤至生物有限公司(货号：AB-P-R001)；一抗：基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)购自武汉三鹰生物技术有限公司(货号:10374-2-AP);基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion,VCAM-1)购自美国Affinity公司(货号分别为AF0220、DF6082);细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion,ICAM-1)购自英国Abcam公司(货号:Ab179707)；CSE购自武汉爱博泰克生物科技有限公司(货号：A11727)；HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司(货号：BA1054)。

4.实验仪器：JT-12J电脑生物组织脱水机购自武汉俊杰电子有限公司；RM 2016轮转式切片机购自德国Leica公司；BX53型生物显微镜购自日本奥林巴斯公司；JK-6生物组织摊烤片机购自武汉俊杰电子有限公司；全自动生化分析仪购自美国Rayto公司；离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；电热恒温培养箱购自日本ASONE 公司；FlexStation 3多功能酶标仪购自美国Molecular Devices 公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；电转仪购自北京六一仪器厂。

5.动物分组、造模及给药：将实验动物编号，随机分为正常组、模型组、葱白提取物组、辛伐他汀组，每组10只。参照郭延松等的方法制备动脉粥样硬化模型，第5周开始，按照《人和动物及各类动物间药物剂量的换算方法》，以成人每日服用剂量换算为大鼠用药量，葱白提取物组大鼠给予葱白提取物600mg/kg灌胃，给药体积10ml/kg，辛伐他汀组给予辛伐他汀混悬液600mg/kg灌胃，给药体积10ml/kg。正常组、模型组均给予等容积0.9%氯化钠溶液10ml/kg灌胃，连续8周。

6.标本采集：第12周，各组大鼠禁食过夜，从腹腔注射戊巴比妥麻醉后，腹主动脉取血，继之插管入升主动脉。先用0.9%氯化钠溶液冲洗，解剖后取下整段主动脉，部分灌注含1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液备用，部分主动脉置于-80℃冰箱备用。

7.主动脉病理学观察：取大鼠主动脉制备病理切片，进行Masson染色。

8.检测血脂水平：全自动生化分析仪检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)水平； ELISA法检测血清载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)水平。

9.RT-PCR检测大鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1、CSE及心肌CSE mRNA表达水平：Trizol法提取大鼠主动脉组织RNA。再依次加入Oligo (dT) 18(10μmol/L) 2μg、dNTP (2.5mmol/L) 4μg、5×Hiscript Buffer 4μg、Hiscript Reverse Transcriptase 1μg、Ribonuclease Inhibitor 0.5μg、RNA 4μl，最后用ddHO滴定至20μl，分别于25℃孵育5min，50℃孵育15min，85℃孵育5min，4℃孵育10min。实时荧光定量PCR检测，将cDNA稀释8倍，以Rat GAPDH为内参，经过95℃预变性10min，再循环重复95℃变性15s、60℃退火延伸60s共40次，最后60℃ 60s、95℃ 15s溶解曲线采集。用QPCR算法(相对定量，2-法)进行相对表达量计算。所用引物序列详见表1。

10.Western blot法检测主动脉MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、CSE表达水平：制备蛋白样品，测定蛋白浓度，计算蛋白上样量,5×蛋白上样缓冲液加热使蛋白变性，制备电泳胶进行电泳分离，根据marker切下目的条带进行电转移(转膜条件：MMP7：200mA 70min，MMP9、ICAM-1、VCAM-1：200mA 120min后300mA 15min，CSE、GAPDH：200mA 90min)，用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)封闭2h，用封闭液稀释一抗(稀释比例详见表2)，4℃孵育过夜，洗去多余一抗，再加入稀释的HRP标记羊抗兔二抗(1∶50000)，室温摇床孵育2h，洗去多余二抗，显色曝光，晒干胶片，用BandScan分析胶片灰度值，以兔多抗GAPDH作为内参。

结 果

1.主动脉Masson染色:正常组主动脉管壁厚度均匀，内膜光滑，胶原纤维和平滑肌细胞排列整齐。模型组管壁厚度不均匀，血管内膜增生，胶原纤维呈蓝色染色，血管平滑肌细胞呈红色染色，胶原染色不均，排列紊乱迂曲。与模型组比较，葱白提取物组和辛伐他汀组管壁胶原纤维染色均匀，排列较为整齐，血管内膜增生较轻(图1)。

2.血脂水平：与正常组比较，模型组TC、TG、LDL-C、ApoB水平均明显升高(<0.05)，HDL-C水平明显降低(<0.05)。与模型组比较，葱白提取物组和辛伐他汀组TC、TG、LDL-C、ApoB水平均明显降低(<0.05)，HDL-C水平明显升高(<0.05),详见表3。

3.大鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1、CSE及心肌CSE基因mRNA表达水平：与正常组比较，模型组大鼠主动脉ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA表达均上调，主动脉及心肌CSE mRNA表达均下调。与模型组比较，葱白提取物组与辛伐他汀组主动脉ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA表达均下调，主动脉及心肌CSE mRNA表达均上调(表4)。

4.主动脉MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、CSE表达水平：与正常组比较，模型组大鼠主动脉MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1表达均上调，CSE表达下调。与模型组比较，葱白提取物组和辛伐他汀组主动脉MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1表达均下调，CSE表达上调(表5、图2)。

讨 论

动脉粥样硬化病变过程历经脂质条纹、纤维斑块、粥样斑块，斑块稳定性降低、斑块破裂甚至血栓形成。目前大量研究证实，血脂水平异常对AS进展有预测意义。LDL-C会导致动脉粥样硬化，而HDL-C则能对抗损伤反应这一病理过程。前期实验已证实葱白提取物具有调节AS大鼠血脂水平的作用。本实验结果也支持葱白提取物具有改善内膜增生、降低血清TC、TG、LDL-C、ApoB及升高HDL-C含量的作用。

细胞黏附分子是AS的炎性成分中的重要元素，有助于单核细胞和淋巴细胞的活化及募集。ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族成员，ICAM-1可通过促进内皮细胞激活、增加血管壁内的炎性反应而促进动脉粥样硬化斑块形成。ICAM-1、VCAM-1与AS的严重程度呈正相关，被证实为AS病理变化及斑块进展的潜在机制。本实验结果提示，葱白提取物能够抑制ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA及ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达，从而发挥抗AS作用。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)参与了AS病变重构，能够引起血管细胞外基质的局灶性破坏，细胞外基质的破坏和无休止的单核-吞噬细胞堆积可以加速斑块破裂。MMP7由巨噬细胞表达，能促使斑块核心扩张、纤维帽稀疏、血管平滑肌细胞凋亡，是AS进展的有害因素。MMP9主要来源于单核-吞噬细胞，可降解AS斑块纤维帽，参与不稳定斑块形成。本实验证实，葱白提取物可抑制MMP7、MMP9的表达，发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

CSE是脉管系统中主要的HS产生酶。HS已被证明可以多方面抑制AS的进展，如抑制氧化应激、抑制炎性反应、抑制细胞凋亡与一氧化氮相互作用等。本实验证实，葱白提取物可以提高主动脉及心肌CSE的表达水平。有研究证实，外源性补充HS，可使MMP7、MMP9表达显著升高，同时能明显抑制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的ICAM-1、VCAM-1表达。

综上所述，本研究证实葱白提取物能够调节血脂、抑制黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)和基质金属蛋白酶(MMP7、MMP9)表达而发挥抗动脉粥样硬化作用，其机制可能与促进CSE表达、调节CSE/HS通路相关。