基于“成分-抗氧化”关联的不同发酵程度茶及茶饮料比较评价

王越，翟佩佩，鲍锋，张富坤，赵盼，李佳，赵东升

（山东中医药大学药学院，济南 250355）

茶，主要由山茶科植物茶（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）的嫩叶经过杀青、发酵等工艺制作而成，因其清香醇厚的特质及发挥的许多功能而深受全球人们的喜爱，并成为近年来国内外食品研究和开发的热点之一［1，2］。研究报道已经证实了茶的各种生物学功能，如抗氧化、抗炎、抗过敏、抗微生物和抗癌以及预防心血管疾病等［3，4］。

氧自由基在多种疾病的发生和发展过程中起着显著性的促进作用［5-7］。当人体内的氧自由基产生负面影响后，会导致各种疾病的产生，可以通过摄入具有天然抗氧化功能的药食两用植物活性成分来增强抗氧化作用，辅助机体能更好地对抗疾病。茶含有多酚类、嘌呤碱、糖类、维生素和茶色素等营养成分，其中主要功能性化学成分是茶多酚、咖啡碱以及茶多糖［8］。其中，茶多酚能够高效地清除多余自由基，防止活性氧簇的形成，具有很强的抗氧化功能［9，10］。

茶叶根据发酵的程度不同，可以分为3大类型，即未发酵茶、半发酵茶和全发酵茶。茶中主要功能性成分的组成和含量会因茶叶类型、品质以及水温和冲泡时间等因素呈现一定差异［11］。Zhang等［12］利用GC×GC-TOFMS技术与多变量数据分析发现，不同发酵程度的茶中化学成分存在显著性差异。茶及茶饮料中所含化学成分种类较多，目前对于不同类型茶的化学成分及其抗氧化活性的研究很多，但大多研究报道集中在单一类型茶叶如绿茶［13］、普洱茶［14］的活性成分或功能以及不同类型茶叶单一活性成分或功能方面［15-17］。鉴于中药“化学成分-生物活性”综合质量评价的新模式［18，19］，仅通过单一类型的活性成分或生物功能作为评价指标，不能综合系统地比较分析不同发酵程度的茶及茶饮料。因此，本研究基于“化学成分-抗氧化活性”关联的研究模式，通过多元化的交叉模式将不同发酵程度茶及茶饮料的活性化学成分和抗氧化功能结合，科学地对不同发酵程度茶及茶饮料进行对比分析［20］，以期为茶叶资源的进一步深入开发利用及养生保健茶饮料的品种选择提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

未发酵茶（日照绿茶）、半发酵茶（铁观音）、全发酵茶（红茶）、未发酵茶饮料（绿茶）、半发酵茶饮料（乌龙茶）和全发酵茶饮料（红茶）购自济南市长清大学城银座超市，其中茶饮料除茶叶和水外仅添加少量维生素C和防腐剂，保持原本茶汁风味；芦丁（纯度大于98%）、没食子酸（纯度大于98%）购于上海源叶生物科技有限公司；甘氨酸（纯度大于98%），上海麦克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH，纯度大于97%）、无水葡萄糖，阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 主要仪器与设备

X-5型METASH紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Thermo Sorvall ST16R型高速低温离心机，赛默飞世尔科技有限公司；DRHH-S4型数显恒温水浴锅，上海程捷仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄酮、多酚、游离氨基酸、多糖的提取将3种茶叶磨成粉末，过4号筛，分别精确称取0.50 g，置于50 mL干燥离心管中，精密加入20.00 mL去离子水，密封，置于水浴（80℃）中加热提取100 min，冷却，离心（13 000 r/min）10 min，取上清液作为茶叶供试品溶液［21］。

1.3.2 黄酮类成分的含量测定参考文献［22］报道的黄酮测定方法测定不同发酵程度茶及茶饮料中黄酮类成分含量，并在其基础上稍作修改。精确称取芦丁标准品2.50 mg，置于25 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别精密移取芦丁标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，加水至2.5 mL，然后加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，加4%氢氧化钠溶液6.0 mL，无水乙醇定容，摇匀，放置15 min，于510 nm波长处测定吸收度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=12.172C+0.003 3（R2=0.999 1），表明芦丁在5.00～25.00 μg/mL范围内呈良好的线性关系。精密吸取茶叶供试品溶液0.2mL、茶饮料1.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，按上述方法测定吸光度，利用标准曲线法计算样品溶液中黄酮类成分的含量。

1.3.3 多酚类成分的含量测定参考王静等［23］的多酚测定方法测定不同发酵程度茶及茶饮料中多酚类成分含量，并在其基础上稍作修改。精确称取没食子酸标准品2.50 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准品溶液。分别取没食子酸标准品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL量瓶中，加入5.0 mL的Folin-Ciocalteu试剂、4.0 mL的7.5%Na2CO3溶液，去离子水稀释至刻度，室温下反应1 h，于760 nm波长下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=44.9C+0.012 4（R2=0.999 5），表明没食子酸在1.00～9.00 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系。将茶叶供试品溶液及茶饮料稀释10倍，精密吸取茶叶供试品溶液0.1 mL、茶饮料0.4 mL，分别置于10 mL量瓶中，按上述方法测定吸光度，利用标准曲线法计算样品溶液中多酚类成分的含量。

1.3.4 游离氨基酸类成分的含量测定参考彭真汾等［24］的游离氨基酸测定方法测定不同发酵程度茶及茶饮料中游离氨基酸类成分含量，并在其基础上稍作修改。精确称取甘氨酸标准品5.00 mg，置于25.00 mL的容量瓶中，加适量去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2 mg/mL的甘氨酸标准品溶液。分别精密移取甘氨酸标准品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于25 mL具塞试管中，加入磷酸缓冲液0.5 mL，茚三酮显色剂0.5 mL，摇匀，置沸水浴中反应15 min，取出，冷水浴冷却至室温，转移至25 mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，静置10 min后，以水代替标准品溶液作空白对照，于波长570 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=183.78C-0.212 2（R2=0.999 1），表明甘氨酸在1.60～5.60 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系。精密吸取茶叶供试品溶液0.2 mL、茶饮料1.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，按上述方法测定吸光度，利用标准曲线法计算样品溶液中游离氨基酸成分的含量。

1.3.5 多糖类成分的含量测定参考张媛媛等［25］的多糖测定方法测定不同发酵程度茶及茶饮料中多糖类成分含量，并在其基础上稍作修改。精确称取无水葡萄糖标准品2.50 mg，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.1 mg/mL的无水葡萄糖标准品溶液。分别精密移取无水葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL量瓶中，加水至2.0 mL，再加入5 %的苯酚溶液1.0 mL，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置10 min，置于40℃水浴保温15 min，取出后稀释至刻度迅速冷却到室温，于490 nm处测得吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=71.815C+0.005 7（R2=0.999 5），表明无水葡萄糖在2.00～10.00 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系。精密吸取茶叶供试品溶液0.1 mL、茶饮料0.4 mL，分别置于10 mL量瓶中，按上述方法测定吸光度，利用标准曲线法计算样品溶液中多糖类成分的含量。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的测定通过测定体外DPPH自由基清除率来评价茶及茶饮料的抗氧化活性［26］。精确称取DPPH 10.00 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.10 mg/mL的DPPH溶液。分别取茶叶供试品溶液及茶饮料0.1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入2.0 mL的DPPH溶液，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，在室温暗处反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度Ai。同等条件下，对照组Aj为0.1 mL样品和2.0 mL无水乙醇，空白组A0为0.1 mL无水乙醇和2.0 mL的DPPH溶液。测定完成后，按照如下公式计算不同浓度的茶叶供试品溶液及茶饮料对DPPH自由基的清除率。

1.4 数据处理

以上试验均平行操作3次，并计算平均值，数据以SD表示。使用GraphPad prism 6.01软件作图分析各类成分含量，采用SPSS 26.0和RStudio软件进行成分含量与抗氧化功能的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵程度茶及茶饮料中成分含量

按亚硝酸钠-硝酸铝法、福林酚法、苯酚-硫酸法、茚三酮比色法分别测定3种不同发酵程度茶及茶饮料中黄酮、多酚、游离氨基酸、多糖类成分的含量，结果如图1所示。不同发酵程度茶及茶饮料中黄酮类成分含量范围分别为19.57～49.25 mg/g、0.19～0.22 mg/mL，其中未发酵茶及茶饮料中黄酮类成分的含量最高，分别为（49.25±0.78）mg/g、（0.22±0.00）mg/mL。不同发酵程度茶及茶饮料中多酚类成分含量范围分别为12.24～24.25 mg/g、0.43～0.83 mg/mL，其中含量最高的为未发酵茶及茶饮料，分别为（24.45±0.98）mg/g、（0.83±0.02）mg/mL，而全发酵茶及茶饮料中多酚类成分含量最低。不同发酵程度茶及茶饮料中游离氨基酸类成分含量范围分别为12.20～14.61 mg/g、0.05～0.07 mg/mL，含量最高的也为未发酵茶及茶饮料，分别为（14.61±0.05）mg/g、（0.07±0.00）mg/mL。不同发酵程度茶及茶饮料中多糖类成分含量范围分别为20.40～31.90 mg/g、0.15～0.19 mg/mL，而含量最高的为半发酵茶及茶饮料，分别为（31.90±0.40）mg/g、（0.19±0.01）mg/mL。

图1 不同发酵程度茶（a）和茶饮料（b）中各类成分含量

从不同发酵程度茶及茶饮料中化学成分含量变化趋势可以看出，经过发酵后，茶及茶饮料中黄酮、多酚和游离氨基酸类成分含量下降显著，而多糖类成分却显著增加，这与文献报道的发酵对茶中化学成分的影响结果一致［27］。茶中黄酮、多酚和游离氨基酸类成分含量分别从49.25、24.45、14.61 mg/g减少至19.57、12.24、12.20 mg/g，而多糖类成分含量却从20.40 mg/g增加至31.90 mg/g。在茶叶发酵制作过程中，随着发酵程度的加深，其多酚类成分呈连续显著性降低的趋势，游离氨基酸类成分先显著性降低后趋于平稳水平，黄酮类呈先降低后稍微升高的趋势，多糖类成分呈先增加后降低的趋势。红茶作为全发酵茶，发酵制作过程中未经过杀青操作，导致红茶中多酚类成分发生酶促反应而氧化成为茶黄素、茶红素等高分子性化合物，使得多酚类成分含量大大降低［28，29］。

2.2 不同发酵程度茶及茶饮料中DPPH自由基清除率

DPPH作为一种较稳定的自由基，其紫红色显著特征在517 nm处具有最大吸收峰。分别测定3种不同发酵程度茶及茶饮料中DPPH自由基清除率，结果如图2所示。不同发酵程度的茶及茶饮料均具有较强的抗氧化能力，其DPPH清除率的大小顺序为未发酵茶＞半发酵茶＞全发酵茶，并且DPPH清除率的大小顺序与多酚类成分含量的顺序相一致。

图2 不同发酵程度茶和茶饮料中DPPH自由基清除率

2.3 不同发酵程度茶及茶饮料成分含量与抗氧化功能的相关性

分析不同发酵程度茶及茶饮料中各类化学成分与DPPH自由基清除率的相关性，结果如表1所示。由表1可知，不同发酵程度茶及茶饮料中黄酮、多酚和游离氨基酸类成分含量都与抗氧化功能表现出良好的相关性，表明茶及茶饮料的抗氧化功能是由黄酮、多酚和氨基酸类成分共同作用的结果。其中，多酚类成分含量均与DPPH自由基清除率呈现显著性正相关（P＜0.05），这与周金伟等［30］的研究结果一致，表明多酚类成分在茶及茶饮料抗氧化功能中起着决定性作用。

表1 不发酵程度茶及茶饮料中成分含量与DPPH自由基清除率的相关性

3 小结

本研究通过紫外-可见分光光度法对3种不同发酵程度茶及茶饮料中黄酮、多酚、游离氨基酸、多糖类成分含量进行了测定并分析其与抗氧化能力的相关性。结果表明，未发酵茶中的多酚和游离氨基酸类成分的含量最高，而发酵茶中多糖类成分含量较高，黄酮类成分含量较低。不同发酵程度茶及茶饮料中黄酮、多酚和游离氨基酸类成分含量与抗氧化功能表现出良好的相关性，说明茶及茶饮料的抗氧化功能主要是由黄酮、多酚和氨基酸类成分共同作用的结果，其中多酚类成分在抗氧化功能中起决定性作用，此研究结果表明“成分-抗氧化”关联的模式能够较系统地对不同发酵程度茶及茶饮料进行比较分析，并为茶叶资源的综合开发利用及茶饮料的品种选择提供一定的科学参考。