甜菜立枯病病原菌的分离和鉴定

刘丹阳，崔汝菲，耿 贵，王宇光

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜是苋科属，2年生草本植物，于世界范围内广泛种植，有较高的经济适用价值[1]。甜菜块根中的糖分含量极高，仅次于甘蔗，是中国第二大糖料作物，其加工品也深受广大民众喜爱[2]。随着集约化生产的进行，追求经济效益最大化的同时，部分农作物也表现出土传病害现象，造成了不同程度的经济损失，甜菜就是典型的土传病害作物之一[3]。甜菜的土传主要病害有立枯病、褐斑病、根腐病等，其中甜菜立枯病又称黑脚病，是甜菜苗期重要的病害之一。导致甜菜立枯病的原因，多为甜菜的生长过程中会受到植物病原菌的侵染，甜菜根茎从而受到损伤，严重影响经济价值[4]。甜菜立枯病的侵染越重，保苗率就越低[5]。在中国各大甜菜产区均有立枯病频发，一般发病率为20%～40%，严重可达60%～80%，甚至毁种[6]。病菌单独或复合侵染可导致立枯病的发生，使得植株养分和水分流失，导致作物减产，同时茎部纤维受损引起植株倒伏[7]。王文君等[8]研究发现，甜菜幼苗受到立枯病菌侵害时，长势明显较弱，真叶出土时间慢，茎基部出现黄褐色病斑等病症。咸洪泉等[9]研究发现，由于种植地区的不同，气候环境等因素影响，导致甜菜苗期立枯病的病原菌不同，常见种类主要有：蛇眼病菌(Phoma betae)、镰孢菌(Fusarium solani)、摔倒病菌(Pythium debaryanum)、丝核菌(Rhizoctonia solani)、苗腐病菌(Aphanomyces cochlioides)。也有研究表示，栽培甜菜上的土传真菌镰孢菌可引起甜菜镰刀菌黄化和立枯病，造成严重的产量损失[10]。然而，土壤传播病原体镰孢菌(Fusarium solani)年复一年地存在于土壤中，早已成为植株病害的致命杀手[11]。镰孢菌的主要种类有腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、黄色镰孢菌(F.culmorum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、木贼镰孢菌(F.equseti)、尖孢镰孢菌 (F.oxysporum)和层 出 镰孢菌(F.proliferatum)等[12]。导致植物立枯病的病原菌有很多种，为找到于甜菜致病的病原菌种类，从而需进行此次实验设计。长期以来，对甜菜病害的发生、分析、防治等国内外有许多报道，但缺乏对甜菜立枯病病原菌种类的了解，可能会对病因判断失误，不能及时控制病害，造成经济损失。本研究通过对黑龙江大学呼兰校区甜菜生长时期的病害调查以及植株病原菌分析，对致病性进行初步研究，以期为哈尔滨市呼兰区甜菜的立枯病防治工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离

甜菜立枯病样品于2021年采自黑龙江哈尔滨市黑龙江大学试验室，甜菜品种为KWS1176，将种子置于甜菜重茬二年的实验土中种植。采用组块分离法，将甜菜幼苗病根剪成1 cm长接入PDA平板，于28℃培养，待长出菌丝后，挑取少量菌丝在PDA培养基上进一步纯化，根据形态学观察和致病性确定菌株，命名为L1，4℃保存备用。

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 形态学观察 在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌丝于光学显微镜下镜检。参考许志[13]的方法观察病原菌形态特征，并对病原菌进行鉴定，初步明确菌株的分类地位。

1.2.2 致病性测定 首先，将甜菜种子种于培养盆中，每盆均匀播种20粒，重复3盆，准备每盆接种病原菌3处。然后，将培养好的菌株L1用打孔器制成8 mm菌饼，接种在培养盆内甜菜生长点的周围，以不接种病原菌为对照。并观察记录甜菜生长和发病情况。同时，将发病部位组织进行再次分离和镜检，对比形态特征是否与接种的菌株一致。

1.2.3 分子生物学鉴定 利用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速提取试剂盒进行菌株基因组提取，并以此为模板进行PCR扩增，引物为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和 ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，采用 25 μL PCR 反应体系：基因组DNA(20～25 ng/μL)0.5 μL、10*Buffer(Mg2+)2.5 μL、dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL、酶0.2 μL、引物 ITS1(10 μmol/L)、引物 ITS4(10 μmol/L)，加 ddH2O至25 μL。反应程序如下：94℃ 4 min；94℃ 45 s，55℃45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min；4℃终止反应。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得序列与BLAST比对，运用MEGA11软件建立系统发育树，确定实验菌株分类地位[14]。

2 结果与分析

2.1 甜菜立枯病病原菌分离

苗期甜菜受到立枯病感染会出现根茎组织受伤发黑，变细，出现倒伏，叶片枯黄等并发症状，见图1。依据发病症状采集菌株样本，而后进行组织分离，获得目标菌株。通过观察分离菌株在PAD培养基上的特征，发现菌株的气生菌丝比较丰富，菌落呈圆形，菌丝为灰白色，生长速度快，菌落呈环形放射状，见图2。

2.2 致病性测定

待幼苗生长至7天时，将L1菌株接种于甜菜幼苗培养盆内的土壤中，实时观察生长。菌株L1接种3天时，甜菜幼苗开始出现病状。从幼苗根茎处开始萎蔫，病处根茎开始枯萎逐渐细小。随着接种菌落时长增加，患病根茎由枯黄逐渐呈现黑色，最后直至甜菜幼苗死亡。在接种菌株5天时，将接种菌株幼苗与未接种菌株CK进行对比，能明显对比出，未接种菌株CK叶片更绿，幼苗根茎更加挺拔，幼苗根茎处未出现枯萎、细小、变黑等染病症状，见图3 a；接种L1菌株的培养盆中，幼苗根茎普遍呈现枯萎状，幼苗叶片泛黄，幼苗地上部倒伏染病症状。观察图3 b可得，接种菌株10天后，甜菜幼苗地上部倒下严重，根茎染病处完全枯萎，呈黑色。

图3 未接种菌株CK与接种菌株对比图

2.3 致病菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定 菌株L1于PAD培养基上生长迅速，菌落为灰白色，表面呈环形放射状。利用显微镜观察，分生孢子呈镰刀型。大型孢子大小为(33.21～49.72)μm×(7.75～9.21)μm，多数有0～3个隔膜，散生于气生菌丝上；小型孢子大小为(16.28～24.28)×(5.52～9.4)μm，多为单细胞，少数有隔膜，形状有卵形、椭圆形，形成于气生菌丝上，见图4。

图4 大型分生孢子和小型分生孢子

2.3.2 分子生物学鉴定 将L1菌株进行分子鉴定，将该菌株的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得约543bp的扩增条带，得到菌株L1的序列长度为543 bp(GenBank的登录号为DQ513513)，见图5。使用Mega11软件构件系统发育树。由图6系统树可知，黑龙江大学呼兰校区甜菜立枯病病原分离物L1菌株与腐皮镰孢菌(Fusarium solanistrain)MW165532.1 39-b处于同一个分支，近缘关系最近。通过结合甜菜立枯病病原菌的形态特征和分子鉴定结果，可将引起黑龙江大学呼兰校区甜菜苗期立枯病的病原菌L1确定为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。

图5 菌株PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳

图6 菌株L1序列系统发育树

3 讨论与结论

镰孢真菌是重要的植物病原真菌之一，是多种植物在生长过程中一大病害，是世界粮食生产体系中重要的致病因素之一[15]。镰孢菌易滋生在潮湿温暖地区，病发严重时可导致作物产量骤减，损失达到50%以上[16-17]。以及不同的地理、气候、土壤等条件的差异[7]，导致不同镰孢菌的组成也各不相同[18]。本实验采集的病原菌试材为黑龙江大学呼兰校区的幼苗期甜菜，该种植地位于中国半干旱地区。推测此病原菌多在甜菜幼苗时期侵染的原因，是由于当地的气候影响，使得甜菜苗期的生长环境过于潮湿，从而利于病原菌的滋生。镰孢菌属中所含毒素，不仅会造成甜菜种子的发芽减少，发育不良等病症，还可引起植株萎蔫和坏死[19]。本实验发现相同的结论，接种病原菌3天后的甜菜幼苗开始出现幼苗倒伏、根茎部枯萎、坏死等情况。镰孢菌单独或复合侵染都可导致立枯病的发生，使得植株养分和水分流失，导致作物减产，同时茎部纤维受损引起植株倒伏[7]。有很多种鉴定镰孢菌基因位点的方法，在前人研究中，ITS、tef1等方法最常使用[20]。如，高园园等[21]基于ITS和tef1基因序列的分子鉴定，构建其基因系统发育树，确定了引起山东大蒜根腐病的主要病原菌为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)。刘文杰等[22]研究结果显示，基于rDNAITS序列构建系统发育树，确定引起山东青岛胶州南瓜果实腐烂的病原菌为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)。本实验通过形态学观察，ITS和tef1基因序列的分子鉴定相结合，构建该基因系统发育树，将分离出的菌株L1确定为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)，为甜菜该病原菌的防控提供了理论基础。但研究该地区甜菜立枯病的病原菌生物学特征的探究是开展有效防控的前提条件，还需要进一步研究。除此以外，腐皮镰孢菌的侵染范围很广[23]，不仅可以造成各种植物的立枯病、根腐病外，还会侵染其他农产品，如桃子[24]、咖啡[25]、香蕉[26]等，造成其果腐病，造成茶叶、刺桐等的叶斑病以及枯萎病[27-28]。本研究中鉴定的L1菌株的侵染范围如何，有待进一步的研究发现，该研究结果可为防控管理该病害的下一步研究提供依据。

综上，本实验通过对黑龙江大学呼兰校区立枯病甜菜进行分离获得菌株L1，并对其进行致病性测定和形态学观察初步确定引起黑龙江大学呼兰校区甜菜立枯病的病原菌是镰孢菌属(Fusarium)真菌。而后进一步确定病原，经过柯赫氏法则认证，通过运用分子生物手段对病原菌进行PCR扩增，并构建系统发育树，确定为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。