基于CiteSpace的球囊霉素相关土壤蛋白知识图谱分析

金涛涛，赵 明，毛洁莹，罗天宇，刘 玮，王 琼

（1江西农业大学林学院，南昌 330045；2江西省森林培育重点实验室，南昌 330045）

0 引言

土壤微生物是地球上多样性最高的生物类群，是土壤有机质与养分转化循环的主要参与者和调节者，在土壤生态系统中发挥着至关重要的作用[1]。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）是一类重要的土壤微生物，能与陆地上近90%的高等植物根系形成共生关系[2]，形成的共生体不仅可以促进植物生长、提高植物的抗逆性[3]，而且对改善土壤结构、维持土壤健康有着积极的效应[4]。1996年，美国WRIGHT等[5]在AMF根内球囊霉菌(Glomus intraradices)菌丝表面发现了一种性质稳定且不溶于水的未知蛋白，此蛋白能和Mab32B11单克隆抗体发生免疫性荧光反应。进一步研究发现，这种蛋白由AMF产生，属于AMF球囊霉属产生并释放到土壤中的专性蛋白，主要由N、C、O、P、Fe等元素组成，最初将它命名为球囊霉素[6]。由于不明确其中是否含有其他非球囊霉素的成分，RILLIG等[7]认为用“球囊霉素相关土壤蛋白”(Glomalin-related soil protein,GRSP)取代球囊霉素更加合理。自GRSP被确定命名后，国内外学者围绕GRSP的分布、结构和功能开展了一系列的研究工作。在分布范围上，大部分生态系统都可以检测到GRSP的存在，WANG&WANG[8]发现森林、农田、草地（灌木）生态系统的GRSP含量集中在0.16～15.67 g/kg。SINGH等[9]总结出农业、森林、沙漠、温带森林、温带草地、热带雨林的土壤GRSP含量分别集中在0.32～0.71 g/kg、1.1 g/kg、0.003～0.13 g/kg、0.6～5.8 g/kg、0.23～2.5 g/kg、2.6～13.5 g/kg。在结构方面，GRSP被认为是一种含有天冬酰胺连接链的糖基化蛋白[6]，其部分氨基酸序列显示与热激蛋白的Hsp60序列相同，该蛋白序列上有3个N端糖基化位点，C端上有一系列GGM氨基酸残基[10]。SCHINDLER等[11]用核磁共振对泥炭土中的GRSP进行分析发现该蛋白质结构主要由碳水化合物、有机质和氨基酸组成。在功能方面，大量研究证实GRSP是土壤碳库的重要组分[12]、土壤健康的指示和调节者之一[13]、改善土壤团聚体结构[14]、增强植物抗逆性[15]及固定土壤重金属[16]等。鉴于GRSP分布广泛、结构复合、生态功能强大，对现有国内外GRSP相关文献进行综合分析，为今后GRSP的研究发展提供一定的参考与借鉴。

目前，国内外关于GRSP的综述都以传统的定性描述为主[17-19]，鲜有使用定量方法进行归纳和总结。传统的文献分析方法存在明显的局限性，数量较多的文献资料查阅耗时较长、重复性大，且易受阅览者主观偏好等因素的干扰，难以在短时间内揭示国内外GRSP研究的动态发展及趋势，且无法直观清晰地概括研究的主要内容及所蕴含的潜在知识。2004年，美国德雷赛尔大学陈超美教授基于Java语言在科学计量学、数据和信息可视化背景下开发了CiteSpace分析软件，中文译为“引文空间”，主要用于对文献数据的统计与分析，显示出某个领域的发展趋势与动态，并在分析与可视化共引网络方面具有准确、多元、高效等特点[20]。其通过可视化的手段呈现科学知识结构、规律和分布情况，获得科学知识图谱，对图谱的解读可转化为对该学科领域发展前沿的分析[21]。如今，多数学者已通过CiteSpace软件对草原碳汇[22]、土壤团聚体[23]、重金属土壤污染修复[24]、土壤有机碳[25]等领域研究进行文献知识图谱解读，并总结归纳出该领域的研究现状及发展动态。

基于此，本文运用CiteSpace软件并结合文献计量学方法对国内外GRSP研究相关文献进行可视化分析，定量梳理GRSP发展脉络，系统总结GRSP研究进程、热点、成果及未来方向，以期为GRSP研究发展带来清晰的思路与启示。

1 数据与方法

1.1 数据来源

本文中研究数据来源于中国知网(CNKI)和Web of Science(WOS)核心合集数据库，检索条件为主题=“GRSP”，由于GRSP是在2004年才被确定命名，所以检索时段设置为“2004—2020”，删除会议报告、书籍介绍等与主题不相关的文献后，共导出中文文献118条、外文文献229条。

1.2 参数设置

将检索到的文献导入CiteSpace5.6.R4中，首先进行参数设置，Time Slicing（时间切片）设置为“From 2004 to 2020#Years Per Slice 1”（“Years Per Slice 1”表示以每1年为一时间切片）。然后根据分析对象不同，Node Type（节点类型）每次分别选择Keyword、Country、Institution以及Cited Reference等来进行可视化。随后分别生成国家、机构、文献共被引关系、关键词共现、突现性关键词等可视化图表。

2 结果与分析

2.1 发文量与时间分析

发文量可直观地反映学术界对某一研究领域的重视程度，一般情况下发文量与该领域研究活跃程度成正比。自2004年球囊霉素被命名为GRSP，十几年来相关文献发表数量较多，中英文共347篇，年均发表量21.7篇，其中GRSP英文文献占65.99%。图1显示了GRSP研究的发文量动态变化，根据发表时间和发表数量，可以将GRSP研究分为3个阶段，即起步阶段（2004—2009年），此时只有英文文献发表，且数量较少；快速增长阶段（2010—2017年），此阶段中英文文献数量不断增加，到2017年达到小高峰；稳定发展阶段（2018—2020年），且WOS和CNKI线性预测趋势线均呈极显著上升趋势(P＜0.01)，表明GRSP研究受到广泛关注，且研究不断深入。

图1 中英文文献数量变化及线性预测图

2.2 国家及机构发文分布特征

CNKI数据库发文所属国家以中国为主，且文献数量较少，因而不对其进行国家及机构聚类分析。利用CiteSpace对WOS文献中不同国家及机构进行分析，形成的网络图谱（图2）可以直观地展现该领域各国的研究情况，并将发文量较高的前10个国家，列于表1。由中心性、连接线等量化值可分析国家的合作紧密程度。图2中每个圆代表一个国家，圆圈大小代表发文数量，以连线表示共被引。由图2可知网络密度为0.0676，表明各国之间合作并不紧密。该领域研究论文发表量较高的国家依次为中国、美国、西班牙、智利、印度等。中国是发表论文量最多的国家，虽然中国起步较晚（2010年），但是近年来对GRSP的研究已与其他国家逐渐缩小差距。而中国、西班牙及智利三个国家中心性最高，表明这3个国家与其他国家间合作次数较多。

表1 国家发文特征及频次统计

图2 国家发文图谱

由图3的机构图谱可知，研究机构以高校和科研院所为主。其中发文量较多的机构为：中国科学院(Chinese Acad Sci)、长江大学(Yangtze Univ)以及智利的拉弗朗特拉大学(Univ La Frontera)。这也再次证明了中国是文献数量贡献最多的国家。其中图谱网络密度为0.01，表明高校和科研院所之间初步形成合作网络，但联系与合作程度依然较低，各研究领域较为独立，未来的合作还有待加强，以期更深入的研究。

图3 机构发文图谱

2.3 文献共被引分析

由于CiteSpace软件对CNKI文献共被引的不支持，所以此处只对WOS中文献进行“Cited Reference”分析，即文献共被引分析，形成文献引证网络图谱（图4）。图谱共生成519个节点，1503条连线，网络密度为0.0112。每个圆代表一篇文献，圆圈大小表明文献共被引频次，频次越大说明文献越突出。由图4可知，视图中最突出的文章是FOKOM R(2012)[26]（47次）、GILLESPIE AW(2011)[27]（37次）以及RILLIG MC(2004)[7]（32次），中国学者中WU QS(2012)[13]（吴强盛）的研究共被引次数也较多（28次）。

图4 GRSP文献共被引网络

通常，文献共被引次数最多的3篇文章可作为GRSP研究发展的里程碑文献。其中RILLIG等[7]在2004年提出建议使用球囊霉素相关土壤蛋白(GRSP)新术语来描述球囊霉素更为准确，这为后续的研究奠定了基础。GILLESPIE等[27]在2011年使用新的研究手段更深入地探索了GRSP的结构组成，通过X射线、热解场电离质谱以及蛋白质组学等研究手段揭示出GRSP是由蛋白质、腐殖质、脂质和无机物构成的复杂混合物。在此之前，大部分学者仅是对不同生态系统的GRSP含量进行揭示和比较[28-29]，只能对其进行表征研究，而GILLESPIE等[27]推动了GRSP研究领域的深入发展。FOKOM等[26]在2012年通过研究不同土地利用方式（森林、免耕地及耕地）发现GRSP含量存在显著差异，其中森林＞免耕地＞耕地，并指出GRSP在稳定土壤团聚体时发挥着重要作用，提出GRSP含量可作为监测土壤质量的一个重要指标。而中国学者吴强盛等[13]围绕柑橘植物菌根调控、抗旱性开展一系列GRSP相关研究，可通过改善土壤水稳性团聚体结构，并提出了一些重要观点。从这些共被引程度较高的文献可看出，相关研究在GRSP的定名、结构特征、生态功能等方面做出了极大贡献，对于后续GRSP的研究领域发展有重要的指导意义。

2.4 研究热点

关键词是一篇文献的核心思想及内容的提炼与浓缩，出现频率越高的关键词，其受研究学者的关注度越高，因此能够充分反映出相关领域的研究热点[30]。本研究利用CiteSpace软件对文献关键词进行共现及聚类分析，绘制出关键词知识图谱（图5），同时统计出关键词的中介中心性（表2）。关键词由节点表示，关键词出现的次数越多节点越大，表示越受关注。除“GRSP”关键词外，其余均代表了该领域重点关注的研究对象。WOS与CNKI关键词共现图谱中内容几乎趋于一致，表明两个数据库文献中研究内容相似。从图谱与表2中可看出“arbuscular mycorrhizal fungi”出现最多（132次），主要由于GRSP的分泌与AM真菌密切相关；其次出现较多的“aggregate stability”、“carbon”、“organic matter”等关键词表示GRSP的功能研究主要集中在稳定团聚体和碳汇功能；“land use”、“colonization”、“diversity”、“plant”、“elevated CO2”等表明GRSP的影响因素研究也被重视。此外，从CNKI图谱中可看出土壤因子、土壤养分、土壤理化性质及其土壤酶活性出现较为频繁，表明国内的GRSP影响因素研究主要关注于土壤本身。中介中心性是反映节点在网络中重要程度的指标，在一定程度上体现了GRSP研究领域的热点，表2中除GRSP关键词外，中心性最大的两个关键词为“organic matter”和“aggregate stability”，表明有机质与团聚体稳定性一直是GRSP研究领域的热点。

图5 GRSP关键词共现图谱(a：WOS，b：CNKI)

表2 WOS中关键词特征及数量统计

2.5 研究前沿

突现词(Burst terms)是指在一定时间内频率骤增的关键词，可以表征研究前沿的发展动态[31]。因CNKI中文献数量较少，关键词频次达不到CiteSpace突现性要求，故此处只对外文文献做关键词突现性分析（图6）。从关键词突显图谱可看出GRSP领域研究不断深入且呈现出多样化特征。通过文献梳理，可以总结为以下三方面前沿研究。

图6 GRSP研究关键词突显图谱

（1）GRSP的提取纯化研究，包括提取(Extraction)、量化(Quantification)、碳水化合物(Carbohydrate)等关键词，自从GRSP被发现以来，许多科学家都很关注其提取方法和结构特征，但目前它仍然是混合物，无法从土壤中分离获得纯度较高的蛋白，这是由于它的性质在自然状态下十分稳定，难于分解，只有用柠檬酸钠溶液于121℃高温下才能被提取获得[5]。根据提取的难易程度将其分为易提取GRSP（Easily extractable GRSP，EE-GRSP）和 难 提 取 GRSP（Difficulty extractable GRSP，DE-GRSP）两大类[32]。截止目前，研究学者对GRSP的结构特征认知尚不十分明确。通过一些先进的化学技术手段，可以初步确定GRSP主要由碳水化合物组成，并由N连接而成的糖蛋白，其中含有36%～59%的C、33%～49%的O、4%～6%的H、3%～5%的N、0.03%～0.1%的P等[28]。SCHINDLER等[11]采用核磁共振技术分析发现GRSP是一种混合物，主要包括芳香烃(42%～49%)、羧基(24%～30%)、碳和低脂肪(4%～11%)、碳水化合物(4%～16%)等[33]。大部分研究都是通过柠檬酸钠提取方法对GRSP的表征进行探索，但这种方法不能提取纯度较高的蛋白[18]，阻碍了人们对其深入的研究及应用，因此GRSP的结构特征及提取纯化方法研究仍然是未来重点关注的方向。

（2）GRSP的生态功能研究，包括稳定性(Stability)、重金属污染(Heavy metal pollution)、有机碳(Organic carbon)等关键词，GRSP在土壤碳固持、结构改良和重金属固定中发挥着重要作用。首先，GRSP是土壤有机碳的重要组分，并对土壤碳库的变化有明显的指示作用[7]。由于GRSP具有丰富的蛋白质和碳水化合物，这也是对土壤有机碳贡献的基础[34]。有研究表明，GRSP可贡献土壤有机碳的27%左右，土壤腐殖质只贡献了8%左右的碳，GRSP的碳贡献能力是土壤腐殖质的2～24倍[35]。GRSP作为惰性碳组分，可有效防止有机碳的流失，特别是活性碳的损失，从而提高土壤碳汇能力[36]。但是，GRSP如何直接影响土壤碳库，目前研究还未得出较准确的结论。其次，GRSP也被称为“土壤胶水”[37]，能把细小的土壤颗粒粘结成较大的土壤颗粒进而形成稳定的土壤团聚体，改善土壤结构。研究表明，GRSP粘附土壤颗粒的能力比其他碳水化合物强3～10倍[38]，说明GRSP对土壤稳定性有重要意义。不仅如此，GRSP对固定重金属也有积极作用，能有效抑制土壤重金属由根系往植物地上部转运，对重金属起到隔离与固定作用，以减少重金属对植物的毒害作用[39]。GRSP能稳定Pb、Cd、Zn、Cu、Fe、Mn等多种重金属元素[40]，因此可将其应用于重金属污染土壤的生态修复[19]。但目前为止，对于GRSP与重金属的具体螯合机制还尚不明确。综上，GRSP在碳汇、重金属封存及土壤结构改善中都发挥着重要作用。但GRSP在生态功能方面的研究不能只停留在理论水平，其应用方面仍有很大的研究空间，如在一些污染的土壤中（有机物污染、微塑料污染等），GRSP的生态功能是否可以有效发挥。因此，未来的GRSP生态功能研究应主要集中在应用方面，将其改善土壤质量功能落在实处。

（3）GRSP的影响因素研究，包括草地(Grassland)、农业生态系统(Agroecosystem)、菌根(Mycorrhiza)、物理性质(Physical property)等关键词，揭示不同土地利用方式、AM真菌种类、土壤理化性质等对GRSP的影响。GRSP特征差异主要受植物种类、菌根类型、土壤性质变化影响[41-43]。植物能为AMF分泌GRSP提供碳源[44]，所以对于植物量多的生态系统而言，GRSP含量通常也较高，如在耕地[45]、林地[46]、荒地[47]、草地[48]、果园[49]、湿地[50]中，GRSP含量以荒地最低，耕地与果园其次，草地、湿地和林地最高。在退耕还林实验中，GRSP的变化趋势也与植物量密切相关，测定退耕0年、7年、12年、17年、22年、32年的土壤中GRSP含量，结果表明GRSP含量与自然恢复时间呈显著正相关关系[51]。此外，SOUSA等[52]研究发现，与传统的单一种植模式相比，具有多种植物的复合种植方式可以提高GRSP含量，即植物多样性丰富的土壤也会提高GRSP含量[19]。同时，不同AM真菌种类与宿主形成菌根后产生的GRSP也有较明显的差异[53]。AM真菌对宿主植物没有固定性，但有一定的选择性，意味着对不同植物根系侵染程度不同[19,54]，这也会导致GRSP产生差异。此外，土壤性质变化会影响植物及AM真菌的生长发育，进而影响GRSP的产生[19]。目前大多数研究集中于对土壤有机碳、氮、磷、电导率、容重、pH等因子的研究，结果表明GRSP与这些土壤因子密切相关[55-58]。近期在农业生态系统中发现土壤扰动也是限制GRSP产生的重要因素。SEKARAN等[14]指出免耕与耕作相比能显著提高GRSP含量。以上的这些影响因素研究相对单一，未来，我们需要结合植物、土壤和AM真菌三者互作机制深入探讨如何有效提高GRSP产量，同时增加考虑在大环境变化下（如气候变暖、氮沉降、二氧化碳升高等）GRSP的变化趋势研究。

3 结论

本研究利用CiteSpace可视化软件，以CNKI和WOS两大数据库为数据来源，总结分析了2004—2020年的GRSP相关文献，对发文量、国家、机构、文献共被引及关键词进行系统分析，得出以下结论：

（1）GRSP研究经历了三个阶段，2004—2009年的起步阶段，2010—2017年的快速增长阶段，2018—2020年稳定发展阶段，且GRSP发文量呈显著上升趋势。

（2）除中国、美国和西班牙外，其他国家对于GRSP的研究还较少；机构以中国科学院发文量最多，是该领域的中坚力量；未来，国家、机构间还应加强合作，积极推进GRSP领域研究进程。

（3）GILLESPIE AW(2011)、FOKOM R(2012)以及RILLIG MC(2004)三篇文章是GRSP被定义以来最具有里程碑意义的文章，为后面的研究奠定了基础。

（4）GRSP领域的研究热点较多，呈现出多样化及深入化特征，研究内容主要集中在GRSP结构特征、生态功能、影响因素等方面；未来，学者们应在此研究基础上积极拓展GRSP领域的研究内容与范围，丰富和创新GRSP的提取与量化方法，深入探索GRSP的生态功能及应用，明确影响GRSP产量的关键机制。