金骨莲胶囊中红景天苷在大鼠体内的药代动力学研究

陈腾飞，练东银，高云航，宋玲，李晗，侯红平，李建良，彭博，叶祖光，张广平

中国中医科学院中药研究所，北京100029

金骨莲为经典苗药，收载于《国家中成药标准汇编》和《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》，由透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁5味药组成，具祛风除湿、消肿止痛功效，常用于风湿痹阻所致关节肿痛、屈伸不利等。方中大血藤又名红藤、红皮藤，具有清热解毒、活血祛风、止痛功效，用于治疗风湿、类风湿等疾病，能够抑制炎性因子，减轻炎症反应。大血藤主要含有红景天苷、香草酸、原儿茶酸等酚类成分，以及绿原酸、咖啡酸等有机酸类成分。红景天苷为其重要的药理活性成分，药理学研究表明，红景天苷通过调控与骨关节炎相关的TLR4/NF-κB信号通路，减轻大鼠骨关节炎急性期的疼痛和关节肿胀，减少血清中炎性因子的含量而发挥抗炎作用；还可通过HIF-1α/EPO途径降低肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平，促进成骨细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的转录活性，激活HIF-1α通路，降低细胞分化和矿化程度，进而发挥抗细胞凋亡的作用。课题组前期研究表明，金骨莲提取物能明显抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应，减少炎症因子的释放，其抗炎作用与抑制PI3K/Akt途径有关。因此，考察血浆中红景天苷的浓度有利于进一步明确金骨莲的药效物质基础。

高效液相色谱串联质谱（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）技术灵敏度高、重复性好、特异性强，样品前处理方法相对简单，尤其适用于血浆、组织等复杂基质中外源性或内源性成分的浓度测定。目前已有文献报道血浆中红景天苷的检测方法及其单体或复方给药后大鼠体内的药代动力学研究，但现有方法或灵敏度较低，或分析时间较长，或生物样本用量大，且未见报道连续给药后红景天苷在体内是否有蓄积效应。因此，本研究建立HPLC-MS/MS测定血浆中红景天苷浓度的方法，用于金骨莲连续14 d给药后大鼠体内红景天苷药代动力学的研究。

1 仪器、试药与动物

Qtrap 5500超高灵敏度三重四极杆串联线性离子阱液质联用系统，包括ExionLC AC液相色谱仪和Qtrap 5500质谱仪（美国SCIEX公司）；MS105DU十万分之一电子天平（德国Mettler-Toledo 公司）；RVC 2-18 CDplus 真空浓缩仪（德国Christ 公司）；Centrifuge 5254R 离心机（德国Eppendorf 公司）；Vortex-genie2 G560E 漩涡仪（美国SCIENTIFIC INDUSTRIES公司）。

红景天苷（Salidroside，98.6%，批号110818-202009），中国食品药品检定研究院；水杨苷（Salicin，内标，98.0%，批号L810U79），北京百灵威科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck公司；甲酸（色谱纯），美国ROE SCIENTIFIC公司；丙酮（色谱纯），美国Thermo Fisher Scientific 公司；纯净水，中国杭州娃哈哈集团有限公司。金骨莲胶囊提取物（批号20190314），贵州益佰制药股份有限公司。

SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。动物试验经中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准（2021B196）。于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房适应性饲养至少5 d，温度（23±1）℃，湿度50%±15%，12 h 昼夜交替。

2 方法与结果

2.1 标准曲线溶液及质控溶液制备

精密称取红景天苷适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解后定容至刻度，摇匀后，用甲醇稀释成浓度为1.00 mg/mL的红景天苷贮备液。用甲醇按一定比例将贮备液稀释成红景天苷浓度依次为10 000、7 500、5 000、2 000、1 000、200、100 ng/mL的系列标准曲线溶液，以及红景天苷浓度为7 500、2 000、200、100 ng/mL的质控溶液，-80 ℃冰箱冷冻保存。临用前，用空白血浆将上述标准曲线溶液和质控溶液稀释10倍，制成标准曲线样品和质控样品。

2.2 内标溶液制备

精密称取水杨苷适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解后定容至刻度，摇匀后，用甲醇稀释成水杨苷浓度为1.00 mg/mL的内标贮备液。用丙酮按一定比例将其稀释成水杨苷浓度为50 ng/mL的内标溶液，-80 ℃冰箱冷冻保存。

2.3 血浆样品处理

精密吸取血浆样品50 μL，置1.5 mL离心管中，加入400 μL 内标溶液，涡旋1 min，超声处理（频率40 kHz，下同）1 min，4 ℃、14 000 r/min离心5 min，取上层溶液350 μL，45 ℃、1 700 r/min减压浓缩至干燥，各加入100 μL甲醇，涡旋1 min，超声处理1 min，4 ℃、14 000 r/min 离心5 min，取上清液10 μL 进样分析。

2.4 色谱及质谱检测条件

色谱条件：采用飞诺美Kinetex C18 100 Å色谱柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），流动相为甲醇（B）-水（A），梯度洗脱（0～1 min，5%B；1～1.5 min，5%～85%B；1.5～2.5 min，85%B；2.5～2.6 min，85%～5%B；2.6～5 min，5%B），流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量10 μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），负离子模式，检测方式为多反应监测（MRM），气帘气35 psi，碰撞气为Medium，喷雾电压-4 500 V，辅助气加热温度500 ℃，辅助气1 为45 psi，辅助气2 为45 psi。红景天苷和水杨苷（内标）定量分析离子对（）分别为299.0→119.1 和285.2→123.1，碰撞能分别为-17.6 V和-24.1 V，去簇电压分别为-44.2 V和-81.7 V。

2.5 方法学考察

按2020 年版《中华人民共和国药典》（四部）“9012 生物样品定量分析方法验证指导原则”进行方法学验证，包括选择性、线性、定量下限、精密度与准确度、基质效应和提取回收率，以及稳定性等。

2.5.1 选择性考察

取大鼠空白血浆各50 μL，分别加入400 μL丙酮、400 μL内标溶液进行蛋白沉淀处理后，再按“2.3”项下方法制备空白血浆样品和内标样品；取“2.1”项下标准曲线样品50 μL、给药后血浆样品50 μL，按“2.3”项下方法处理，制备含标准品血浆样品和大鼠给药后6 h血浆样品。上述4种样品按“2.4”项下方法进行处理和分析，得红景天苷和内标水杨苷在不同样品中的提取离子流色谱图，见图1。结果显示，金骨莲胶囊中的待测成分红景天苷的保留时间为3.91 min，内标的保留时间为3.94 min，峰型良好。空白血浆中相应的保留时间无明显的内源性物质或杂质的干扰，表明该血浆处理方法和分析方法的选择性良好。

图1 大鼠血浆中红景天苷和内标HPLC-MS/MS图

2.5.2 标准曲线及定量下限考察

取大鼠空白血浆，按“2.1”项下方法配制7个浓度的标准曲线样品（红景天苷浓度依次为1 000、750、500、200、100、20、10 ng/mL），按“2.3”和“2.4”项下方法进行处理和分析，以待测物与内标峰面积比值为纵坐标，待测物浓度为横坐标，采用加权（1/）最小二乘法进行线性回归，得回归方程＝0.001 19＋0.005 38，＝0.999 1，线性范围为10～1 000 ng/mL，线性关系良好，定量限为10 ng/mL（信噪比S/N＞10）。

2.5.3 精密度与准确度

取大鼠空白血浆，按“2.1”项下方法制备红景天苷浓度为10、20、200、750 ng/mL的定量下限、低、中、高4个浓度质控样品，按“2.3”和“2.4”项下方法进行处理和分析，平行操作6份样本，测定3 d。根据当日标准曲线，分别计算质控样品的测得浓度，与标示浓度对照，计算准确度，并计算批内和批间精密度。结果显示，红景天苷的批内精密度RSD为1.9%～6.4%，准确度为100.1%～108.0%；批间精密度RSD为3.5%～6.1%，准确度为102.1%～106.4%，均符合相关要求，提示该方法的准确可靠，重复性良好。

2.5.4 基质效应和提取回收率

取娃哈哈纯净水50 μL，按“2.3”项下方法加入内标溶液并浓缩干燥，之后加入100 μL对应浓度的低、高浓度质控溶液复溶，处理后取上清采用“2.4”项下方法进行分析，测得红景天苷的峰面积为A（每个浓度平行6份）；取大鼠空白血浆50 μL（6个不同来源），按“2.3”项下方法加入内标溶液并浓缩干燥，之后加入100 μL对应浓度的低、高浓度质控溶液复溶，处理后取上清采用“2.4”项下方法进行分析，测得红景天苷的峰面积为B；取大鼠空白血浆（6个不同来源），按“2.1”项下方法制备低、高浓度的质控样品，按“2.3”和“2.4”项下方法进行处理和分析，测得红景天苷的峰面积为C。B与A的比值为基质效应，C与B的比值为提取回收率。结果显示，红景天苷的基质效应为32.1%～61.9%，存在一定的基质抑制作用，RSD 为11.0%～14.1%，说明个体间的基质效应差异不大，通过标准曲线校正后，不影响生物样品定量分析的准确性。血浆样品中红景天苷的提取回收率为33.3%～51.7%，RSD为11.4%～11.7%。

2.5.5 稳定性

选择低、中、高3个浓度的质控溶液，以空白大鼠血浆按“2.1”项下方法制备相应浓度的质控样品，各浓度质控样品分别在室温放置2 h、-80 ℃→室温冻融2次、-80 ℃放置30 d后，按“2.3”和“2.4”项下方法进行处理和分析，并将样品处理后在进样器放置24 h后，按“2.4”项下条件进行分析，每个浓度平行6份样品。以当日新配制的随行标准曲线计算样品浓度及各质控样品的精密度和准确度，考察样品放置稳定性。结果显示，红景天苷室温放置2 h后各浓度质控样品的准确度为103.1%～104.3%，精密度RSD 为2.0%～5.9%；-80 ℃→室温冻融2次后各浓度质控样品的准确度为97.0%～107.1%，精密度RSD 为4.2%～4.9%；-80 ℃放置30 d后各浓度质控样品准确度为102.4%～103.1%，精密度RSD为1.4%～2.7%；进样器放置24 h后各浓度质控样品的准确度为101.7%～107.3%，精密度RSD为2.8%～9.6%，表明上述处理条件及放置条件下样品稳定，可以满足定量分析的要求。

2.6 药代动力学研究

雄性SD大鼠5只，适应性饲养后，于实验前禁食12 h，自由饮水。金骨莲胶囊提取物用0.5%CMC-Na溶解后，按10 mL/kg灌胃给药（相当于60 g原药材/kg），连续给药14 d，分别于第1、14日给药后0.083、0.167、0.333、0.667、1、2、4、6、8、10、12、24 h经大鼠眼眶静脉丛采血约0.2 mL，置于肝素钠抗凝的离心管中，12 000 r/min离心3 min，转移血浆，-80 ℃冰箱冷冻保存。采用已建立的分析方法对血浆中的红景天苷进行定量分析，并采用MaS Studio 1.5.2.14软件计算灌胃给药金骨莲胶囊提取物后大鼠体内红景天苷的药代动力学参数（非房室模型），对第14日和第1日给药后的药代参数进行单因素方差分析（One-way ANOVA），＜0.05表示差异具有统计学意义。

取各时间点血浆样品，按“2.3”项下条件处理，按“2.4”项下方法进行分析，以当日配制的随行标准曲线计算红景天苷血药浓度，绘制平均血药浓度-时间曲线，见图2。

图2 大鼠连续14 d灌胃金骨莲胶囊提取物的红景天苷药-时曲线（x±s，n＝5）

采用非房室模型计算红景天苷的药代动力学参数，并进行统计分析，结果见表1。第14 日给药后、AUC、AUC、MRT、MRT分别为（1 123.57±88.35）ng/mL、（2 861.62±514.98）ng·h/mL、（2 867.93±514.60）ng·h/mL、（1.56±0.21）h、（1.58±0.21）h，与第1日给药后的各参数相比较，均无显著性差异，说明连续给药后红景天苷在大鼠体内的暴露量和平均驻留时间无明显增加，未发现蓄积效应。另外，与第1日给药金骨莲胶囊提取物后比较，第14日给药后红景天苷的明显缩短（＜0.01），明显提前（＜0.05），说明连续给药后大鼠体内红景天苷消除变快。

表1 红景天苷给药不同时点主要药代动力学参数（x±s，n＝5）

3 讨论

本研究建立了大鼠血浆中红景天苷浓度测定的HPLC-MS/MS方法，并以此快速、灵敏、准确分析了灌胃给药金骨莲胶囊提取物后大鼠血浆中红景天苷的浓度，系统考察了连续14 d给药金骨莲后红景天苷的药代动力学特征，初步明确了红景天苷的体内暴露程度和体内过程，为苗药金骨莲药效物质基础的深入研究提供了参考。

首先，对蛋白沉淀试剂进行优化。蛋白沉淀试剂的选择，直接影响到样品处理的结果。本试验分别考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯及二氯甲烷作为蛋白沉淀试剂，处理含有同等浓度的红景天苷血浆样品，发现丙酮处理后，样品中红景天苷的峰面积最大，灵敏度更高，因此选择丙酮作为蛋白沉淀试剂。

其次，优化了色谱条件。流动相及色谱条件也会影响测定结果，本试验考察了不同品牌的C18色谱柱，以及乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%甲酸水及甲醇-0.05%甲酸水等不同的流动相系统，并优化了等度和梯度洗脱程序，结果表明飞诺美Kinetex C18 100 Å色谱柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）在4种流动相系统均能获得较好的色谱峰形，综合考虑色谱柱的清洗、保护及保存等因素，最终选择甲醇-水梯度洗脱的方式作为流动相系统。

采用以上条件建立的HPLC-MS/MS 方法能够快速、灵敏、准确分析大鼠血浆中红景天苷的浓度，适用于药代动力学研究。通过药代动力学研究发现，给药金骨莲后，红景天苷在大鼠体内迅速被吸收并达到峰浓度，第14日给药后的达峰时间和半衰期比第1日给药后均有所减少，分析原因可能是金骨莲胶囊是复方制剂，成分种类较多，单次或连续给药后会产生复杂的药物-药物相互作用及不同药物成分与肝药酶的相互作用，使红景天苷的吸收、代谢和排泄发生改变。大鼠1次/d连续14 d给药金骨莲，末次给药后大鼠血浆中红景天苷的峰浓度、体内暴露量（曲线下面积）及平均驻留时间与首次给药后相比较，均无明显升高，表明连续给药金骨莲后红景天苷无蓄积效应。