基于生物信息学分析归属人参属化学成分及黑参药性

刘琳琳，窦德强

辽宁中医药大学，辽宁 大连116600

黑参为五加科植物人参C.A.Mey.的干燥根和根茎经多次蒸晒（九蒸九晒）得到的一种人参制品。黑参较生晒参、红参有更强的生物活性，如抗炎、抗氧化、增强免疫功能、降血糖、抗肿瘤等，但对黑参的相关报道较红参和生晒参少，《中华人民共和国药典》关于人参炮制品的记载只有红参和生晒参。黑参最早产于韩国，近几年我国也进行了黑参的开发研究，如本课题组已与辽宁地方企业实现了黑参产业化，并制定了辽宁省地方标准《黑参加工技术规程》，为黑参资源的质量控制和开发应用提供参考。本研究基于网络药理学和分子对接，以人参属中药三七、红参、人参、西洋参、人参叶为研究对象，对其化学成分、靶点进行挖掘，以特异性通路→靶点→化学成分模式筛选出调控寒热药性的靶点，通过分子对接以热力值的形式进一步筛选调控寒热药性的关键靶点，并进行药理实验验证，利用多元统计分析归属黑参的药性，为临床用药提供指导。

1 资料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 KEGG通路富集分析及反向找靶

人参为五加科植物人参C.A.Mey.的干燥根和根茎，性微温。红参为五加科植物人参C.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎，性温。西洋参为五加科植物西洋参L.的干燥根，性凉。人参叶为五加科植物人参C.A.Mey.的干燥叶，性寒。三七为五加科植物三七（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根茎，性温。以上人参属中药的药味均为甘、微苦。利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分别查找5味药的主要活性成分及其相关靶点。利用R3.6.3 软件对相同药性药材的靶点进行KEGG通路富集分析。通过对比去重的方法剔除寒凉、温性中药共同涉及的代谢通路，得到寒凉性中药和温性中药的特异性代谢通路。

1.1.2 药性归属及黑参药性预测

以“特异性通路→靶点”模式，通过通路反向找各药靶点，剔除寒热药共有靶点后得到寒热特异性靶点，运行化学成分-寒热特异性靶点-寒热特异性通路网络分析各靶点度值（degree），统计相同药性中同一靶点degree。在此基础上对药性赋值（寒＝-2、凉＝-1、微温＝0.5、温＝1），并与degree加权，归属排序各靶点所调控的药性。统计相同药性中同一化合物degree，并对其进行加权处理，归属其寒热药性。根据文献对黑参化学成分及含量的报道，初步预测黑参的药性及其物质基础。

1.1.3 药性调控关键靶点筛选

药性与机体的能量代谢密切相关，即热性药促进能量代谢而寒性药抑制能量代谢。因此，将预测得到的寒热药性相关靶点按矢量值大小依次输入KEGG PATHWAY Database（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html），找出与能量代谢直接相关的靶点（参与糖代谢、氨基酸代谢通路的靶点），取矢量值较大的前5个靶点作为分子对接靶点。借助RCSB PDB数据库（http://www.rcsb.org/）选择其最佳靶点蛋白晶体结构，下载靶点的3D结构，采用TCMSP下载寒热相关成分的结构mol2格式文件。通过AutoDock软件进行分子对接，以对接评分（docking score）为依据评价化合物与受体匹配情况，分别找出与寒热药性相关的关键靶点及其上下游蛋白酶，用于实验验证。

1.2 黑参药性实验验证

1.2.1 动物、仪器与试药

SPF级昆明种雄性小鼠80只，体质量18～22 g，5～6周龄，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号SCXK（辽）2020-0001，饲养于辽宁中医药大学SPF级动物实验室温度（23±2）℃、湿度60%～70%环境，昼夜12 h自然光照，自由摄食饮水。

DZKW-D-2电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；TDZ4-WS台式低速离心机，湘仪离心机厂；Caretium酶标仪，深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司；UV-2100紫外分光光度计，上海UNICO公司。

人参叶（批号20200910）、红参（批号20200910）购于吉林省抚松县，黑参（批号20200910）购于辽宁中书堂黑参有限公司，经辽宁中医药大学药学院王冰教授鉴定，分别为五加科植物人参C.A.Mey.的干燥叶、五加科植物人参C.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎、五加科植物人参C.A.Mey.的栽培品经多次蒸晒（九蒸九晒）后的干燥根和根茎。分别取人参叶、红参、黑参药材粉末，加10 倍量蒸馏水，文火煎煮提取2次，第1次提取2 h，滤布过滤，滤液趁热抽滤，得上清液，第2次提取1 h，滤布过滤，滤液趁热抽滤，得上清液，合并2次上清液作为水煎液，分别浓缩至0.292 5 g/mL（低剂量）和0.585 0 g/mL（高剂量），4 ℃保存备用。

BCA 测试盒（批号20201205）、超微量Na-K-ATP 酶测试盒（批号20201208）、乙酰胆碱酯酶（AchE）测试盒（批号20201208）、环磷酸腺苷（cGMP）测试盒（批号2020122）、环磷酸鸟苷（cAMP）测试盒（批号2020122），南京建成生物工程研究所；皮质酮（CORT）测试盒（批号202012）、三碘甲状腺原氨酸（T3）测试盒（批号202012）、甲状腺素（T4）测试盒（批号202012）、细胞色素C氧化酶（COX）测试盒（批号202012），凡科维青岛柏舟生物科技有限公司。氢化可的松注射液（20 mL/支，5 mg/mL），天津金耀药业有限公司。

1.2.2 分组、造模及给药

小鼠适应性饲养1周后，按体质量分层随机分为空白对照组、模型组、红参低剂量组、红参高剂量组、黑参低剂量组、黑参高剂量组、人参叶低剂量组、人参叶高剂量组，每组10只。除空白对照组外，各组小鼠每日灌胃氢化可的松溶液25 mg/kg，连续30 d。造模8 d起，各给药组分别灌胃相应药物水煎液，低剂量组5.85 g/kg，高剂量组11.7 g/kg，灌胃体积均为0.4 mL/20 g。空白对照组及模型组灌胃等量蒸馏水，连续21 d。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 一般状况

每7 d称量小鼠体质量，每日观测小鼠毛发、行为活动等是否有异常状况。

1.2.3.2 血清代谢指标含量测定

末次给药后，小鼠禁食不禁水24 h，摘除眼球取血，2 500 r/min离心10 min，取上清液，分装，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 测定T3、T4、CORT、COX、cGMP、cAMP含量，采用紫外分光光度法测定AchE活力，按试剂盒说明书操作。

1.2.3.3 肝组织Na-K-ATP酶活力测定

取各组小鼠肝脏相同部位，称重后置于匀浆器中，按1∶9比例加入0.01 mol/L生理盐水，冰浴条件下进行组织匀浆，2 500 r/min离心20 min，取上清液，分装，于-80 ℃冰箱保存。采用紫外分光光度法测定Na-K-ATP酶活力，按试剂盒说明书操作。

1.3 多指标综合分析归属黑参药性

1.3.1 主成分分析

利用SIMCA-P软件对各指标数据进行趋向分析，以空白对照组、寒性模型组为基准，各给药组与基准组之间的距离为主要因素，各给药组图形离散程度为次要因素，对黑参的药性进行归属。

1.3.2 聚类分析

将各组指标数据与模型组比较：较模型组显著升高时，＜0.05赋值为1，＜0.01赋值为2；较模型组显著降低时，＜0.05赋值为-1，＜0.01赋值为-2；无显著变化赋值为0。采用SPSS25.0软件对各指标差异有统计学意义的结果进行聚类分析，从而判断黑参的药性。

2 结果

2.1 中药物质基础药性归属及黑参药性预测

通过KEGG通路反向找靶，统计相同药性中同一靶点的degree。将药性赋值（寒＝-2、凉＝-1、微温＝0.5、温＝1）与degree加权，按单体化合物矢量绝对值大小，归属其寒热药性。温性中药药性物质基础分析见表1，寒凉性中药药性物质基础分析见表2。

表1 人参属温性中药药性物质基础分析

表2 人参属寒凉性中药药性物质基础分析

经对比分析可知，槲皮素、Rh、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rc、Rg、豆甾醇、Rb、Rh、Ra、Ra、Ra、Ra、Ro、花生四烯酸、Rg、R、La、山槐树、灌木远志酮A、苏齐内酯等为温性成分。Rh、Re、Rg、山柰酚、β-谷甾醇、Rb、罂粟碱、Rh、Rb、Rh、Rg为寒凉性成分。由单体皂苷药性，结合前期关于黑参皂苷成分及含量的研究，预测黑参的药性可能为温性，其药性物质基础为Rg、Rb、Rc、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rg、Rh。

2.2 药性调控关键靶点

将预测出的靶点按矢量值输入KEGG PATHWAY Database，找出与能量代谢直接相关的温热靶点及寒凉靶点，前5位靶点见表3。将药性物质基础分别与寒热靶点蛋白进行分子对接分析，结果见图1。可知化合物分子与温热靶点GSK3B、PFKFB3及寒凉靶点PTGS1和AchE结合性能较好。选用PTGS1和AchE及其上下游蛋白酶进行后续药理实验。

图1 人参属中药化合物与寒热药性靶点分子对接分数热图

表3 人参属中药寒热药性与能量代谢直接相关的靶点（前5位）

2.3 动物实验结果

2.3.1 一般状况

空白对照组小鼠眼睛有神，活动迅速，背毛浓密、有光泽。造模第7日，体质量降低，出现畏寒蜷缩、闭目无神、精神状态萎靡、少动、大便溏稀及反抗力减弱。造模第14日，小鼠上述状态加重。与模型组比较，各给药组体质量、反应活跃程度均有一定程度改善。

2.3.2 指标测定结果

各组小鼠血清AchE、Na-K-ATP酶活力，COX、cGMP、cAMP含量及cAMP/cGMP水平见图2，各组小鼠血清CORT、T3、T4测定结果见表4。分析可知，红参主要通过调节Na-K-ATP酶活力、COX含量对机体能量代谢产生作用，并通过升高下调的cAMP/cGMP水平缓解阳虚证。黑参主要通过调节CORT含量对内分泌激素水平产生一定影响，并通过调节COX含量对机体能量代谢产生一定作用。人参叶可上调AchE活力，降低cAMP含量，使cAMP/cGMP水平较模型组有下调趋势。

表4 各组小鼠内分泌激素水平比较（x±s，每组10只）

图2 各组小鼠AchE、Na+-K+-ATP酶、COX、cAMP、cGMP及cAMP/cGMP比较（x±s，每组10只）

2.4 主成分分析

利用SIMCA-P软件，对各组小鼠能量代谢指标数据的平均值归一化处理后分别进行主成分分析，高剂量组和低剂量组数据分析结果见图3。可以看出，黑参组与红参组较为趋近。

图3 各组小鼠指标数据主成分分析

2.5 聚类分析

利用SPSS25.0软件，进一步对各组差异性指标数据进行聚类分析，树状图见图4。聚为两类时，人参叶高、低剂量组为一类，黑参高、低剂量组，红参高、低剂量组，以及空白对照组为一类。

图4 各组小鼠差异性指标数据聚类分析

3 讨论

化学成分是中药药效的物质基础，是药性表达的一个方面。同一类药性药物的物质基础可能有共性，结构类似的化合物或成分可能表现出同类药性。本研究以药味、归经、功能、主治相似而药性（气）有显著差别的三七、红参、人参、西洋参、人参叶为研究对象，以特异性通路→靶点模式，通过通路反向找靶，剔除寒热药共有靶点后得到寒热特异性靶点，分析化学成分-寒热特异性靶点-寒热特异性通路网络找出各靶点degree，统计相同药性中同一靶点、化合物degree，在此基础上对药性赋值并与degree加权，归属排序各靶点、化合物所调控的药性。

在预测的寒热相关靶点中找出与能量代谢直接相关靶点，取矢量值较大的前5个靶点作为分子对接靶点，经分子对接得到温热靶点GSK3B、PFKFB3及寒凉靶点AchE、PTGS1与各化合物对接热力值较高，这些可能是揭示寒热药性的关键分子基础。前期研究发现，阳虚模型大鼠AchE活力有降低趋势，给予温性药后AchE活力有升高趋势。酶活力越大，酶含量越高，同时酶的蛋白表达越高。PTGS1、PTGS2作为同工酶分别编码COX1、COX2，是将花生四烯酸合成为前列腺素的关键酶，同时与炎症的发生有着密切联系，表明抗炎解热功效是寒性药性的重要体现。戴逸飞研究表明，寒性中药对酵母致热小鼠下丘脑中PTGS2蛋白表达有一定的下调作用。

当机体处于肾阳虚状态时，全身机能降低，代谢下降，体温降低，免疫功能减退。肾阳虚症与神经-内分泌-免疫系统的功能变化相关。下丘脑-垂体-靶腺轴（肾上腺轴、甲状腺轴和性腺轴）功能障碍或低下是肾阳虚证的基础，任何一轴功能下降，均可引起肾阳虚证。氢化可的松作为外源性糖皮质激素，可升高糖皮质激素水平，从而反馈性地抑制垂体前叶促肾上腺皮质激素的释放，使肾上腺皮质分泌激素减少，导致肾上腺及性腺器官萎缩、免疫器官损害等。动物会出现一系列“耗竭”现象，即体质量下降、活动减少、拱背、蜷缩、被毛疏松无光泽、畏寒等阳虚症状。本研究采用氢化可的松灌胃给药制备阳虚小鼠模型，选取寒凉关键靶点及其上下游蛋白酶作为研究对象，并分别灌胃给予高、低剂量的红参、黑参及人参叶水煎液，观察各组小鼠体征指标及体内指标的变化。结果表明，人参叶与红参和黑参相比，作用效果不显著，可能与其药性为寒性相关。

槲皮素、Rh、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rc、Rg、豆甾醇、Rb、Rh、Ra、Ra、Ra、Ra、Ro、花生四烯酸、Rg、三七皂苷R、La、山槐树、灌木远志酮A、苏齐内酯等成分药性为温性。Rh、Re、Rg、山柰酚、β-谷甾醇、Rb、罂粟碱、Rh、Rb、Rh、Rg等成分药性为寒凉性。对动物实验结果进行多元统计分析可知，黑参的药性为温性，其药性物质基础为Rg、Rb、Rc、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rg、Rh。