不同浓度紫草素对培养大鼠心肌细胞的毒性作用分析

陈菊英 黄文东 高 琦 练晓珊

（1.广州泰和肿瘤医院药学部，广东 广州 510030；2.广东省茂名市人民医院药剂科，广东 茂名 525099；3.广州市妇女儿童医疗中心妇产科，广东 广州 510600）

心脏可以为血液流动提供动力，是循环系统重要的器官之一，临床药物的细胞毒性均可能引起不同程度心脏循环压力，甚至会造成心功能的恶化。采用MTT法可以检测临床药物对心肌细胞存活率[1]。紫草具有凉血、活血功效的中草药，有研究发现，从紫草中提取出来的紫草素、乙酰紫草素对细菌、真菌具有明显的抑制作用。主要通过升高不同类型肾癌细胞中活性氧水平和p38活性来触发程序性细胞死亡，达到抗炎、抗癌等效果[2]。紫草素对多种肿瘤细胞增殖也有抑制效果，其机制是诱导细胞凋亡和抑制新生血管形成，从而起到抗肿瘤作用[3]。但目前紫草素对心肌毒性的作用尚不清楚，有关的动物实验和临床试验较少。基于此，为探讨紫草素对心肌细胞的毒性作用，本研究将采用新生乳鼠的心肌细胞进行研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 试验药物：紫草素购自广州市药检所，纯度＞97%，8mg紫草素溶解于1mL二甲基亚砜（DMSO）中，充分溶解后置于-20℃保存。

1.2 试剂：DMEM培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Science Cell公司；0.25%胰蛋白酶购自杭州吉诺公司；二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司。

1.3 动物：SD大鼠购自中山大学实验动物中心，本研究经动物伦理委员会批准同意使用。

1.4 心肌细胞的分离和培养：将新生（出生1～3d）大鼠用75%乙醇消毒，取其心脏，将心房和血管组织去除，冲洗心室后将其剪碎，剪成1mm左右组织块，加入5mL的0.25%胰酶和0.1%EDTA消化液在摇床中摇匀，温度保持在37℃，以100转/分摇10min，去除消化液。加入新的胰酶，使用滴管吹打3～5次后摇20min，收集消化液，在重复上述操作3次。收集到的消化液使用15%胎牛血清的DMEM培养基中和，使用消毒后的300目尼龙网过滤。过滤液转移至50mL离心管中离心4min，弃上清液，收集细胞，使用15%胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬细胞后分装至培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中进行培养。75min后吸出尚未贴壁的细胞悬液，移至培养板的盖玻片上，24h后换液，清除未贴壁细胞，往后隔2d换液1次，使用显微镜观察细胞形态和生长情况，每天对细胞的自发收缩进行计数和照相。

1.5 MTT检测：将培养24h后的心肌细胞按每孔5×104个细胞接种于96孔板中，在培养2d后，往每孔加入浓度为1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L的紫草素处理，时间分别为48h和72h后，将培养液倒掉，到终点时间时加入2mg/mL的MTT于每孔。37℃培养4h，倒掉MTT溶液，再每孔加入150μL的DMSO液，振荡10min，充分溶解后使用酶标仪在490处测定各孔的OD值。设立空白对照组和正常对照组，空白对照组即无细胞、培养液和MTT；正常对照组，即有细胞和相同浓度的药物溶解介质、培养液和MTT。细胞存活率=（OD样品-OD对照）/（OD对照-OD空白）。

1.6 统计学方法：运用SPSS20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各浓度紫草素处理48h后心肌细胞毒性OD值比较：与对照组比较，紫草素1×10-5mol/L浓度作用时，毒性显著（P＜0.05），其他两个浓度差异无统计学意义（P＞0.05），紫草素为1×10-5mol/L浓度时，OD均值与对照组差异有统计学意义，详见表1，图1。

表1 各浓度紫草素处理心肌细胞毒性OD值比较（±s）

表1 各浓度紫草素处理心肌细胞毒性OD值比较（±s）

组别 减去底色的OD值对照组 0.67±0.0510-7紫草素 0.78±0.1510-6紫草素 0.75±0.1210-5紫草素 0.009±0.007

图1 MTT检测结果（紫草素处理心肌细胞作用48h）

2.2 各浓度紫草素处理72h后心肌细胞毒性OD值比较：与对照组比较，紫草素1×10-5mol/L浓度作用时，毒性显著（P＜0.05），其它两个浓度均差异无统计学意义（P＞0.05），紫草素为1×10-5mol/L浓度时，OD均值与对照组差异有统计学意义，详见表2，图2。

图2 MTT检测结果（紫草素处理心肌细胞作用72h）

表2 各浓度紫草素处理心肌细胞毒性OD值比较（±s）

表2 各浓度紫草素处理心肌细胞毒性OD值比较（±s）

组别 减去底色的OD值对照组 0.83±0.0610-7紫草素 0.77±0.1210-6紫草素 0.82±0.1010-5紫草素 0.015±0.006

3 讨论

近年来，关于中药提取物对心肌细胞毒性作用的相关研究日趋增多。心肌细胞是研究药物毒性试验的试验对象[4]。紫草素在2010版药典中，将紫草素作为紫草的含量和质量测定指标[5-6]。中医上常见紫草作为外用药物，熬膏或用植物油浸泡涂擦方式用于温热斑疹、热毒蕴结引起的多种皮肤疾病，如烧伤、湿疹、丹毒等[7]。以往学者多认为紫草无毒性或小毒性的天然材料，如《名医别录》中认为紫草苦寒无毒[8]。考虑原因是紫草多外用，紫草素进入人体内部的含量相对较少，不会达到有毒的含量。因此，关于紫草素对心肌细胞的毒性尚未清楚。

现代药理研究证实，紫草素可以抑制炎症因子、加速癌细胞凋亡以及抗血管新生等作用，但组织中存在的吡咯里西啶生物碱一定的毒性，阻碍了其药物作用[9-10]。Li等研究表明，紫草素通过激活活性氧（ROS）的产生并抑制细胞内三磷酸腺苷水平、糖酵解相关蛋白和PI3K-AKT-mTOR信号通路，诱导RA-FLS的细胞凋亡和自噬[11]。有研究表示，紫草素在体内实验中具有较高的毒性作用，不同浓度紫草素的毒性有差异[12-13]。本研究结果显示，紫草素浓度为1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L在48h的心肌细胞处理条件下，与对照组比较，紫草素1×10-5mol/L浓度作用时，毒性显著，其它两个浓度均未作出显著毒性。紫草素浓度为1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L在72h的心肌细胞处理条件下，与对照组比较，紫草素1×10-5mol/L浓度作用时，毒性显著，其他两个浓度均未作出显著毒性。提示为紫草素处理浓度小于1×10-6mol/L时，无明显毒性，当紫草素处理浓度为1×10-5mol/L时作用于大鼠心肌细胞48h、72h后产生了明显毒性细胞毒性。综上所述，紫草素具有一定的细胞毒性，紫草素浓度小于1×10-6mol/L时，未表现出明显毒性，当紫草素浓度为10-5mol/L时处理心肌细胞48h、72h后，对大鼠心肌细胞有明显毒性。本研究还存在一定的局限性，未做体内实验，因此心肌细胞采用不同浓度紫草素的体内实验是否会存在毒性反应还需进一步研究。