大鼠脑组织冷冻切片BrdU免疫荧光染色的经验探讨

高家乐，姚明江，张 伟，刘建勋

缺血性脑血管疾病是全球范围内导致患者残疾和死亡的主要原因[1]，脑缺血后可以诱发内源性的神经发生，是机体应对缺血性损伤的一种代偿性保护机制。5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,BrdU)作为DNA碱基胸腺嘧啶核苷的类似物，与胸腺嘧啶核苷相同，在细胞有丝分裂的S期掺入到增殖或分裂细胞的核内[2]，是神经发生中用来标记具有增殖活性细胞的重要指标，常与干细胞、神经祖细胞以及神经元的一些标志物共同标记，以检测新生神经细胞的情况。侧脑室下区和海马齿状回颗粒下区是缺血后神经发生的两个经典位点[3]，本实验以脑缺血大鼠为例，取含有侧脑室和海马的冠状切面脑组织行BrdU免疫荧光染色，通过漂片法探讨冷冻切片BrdU免疫荧光染色的经验，比较是否灌注多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、BrdU新旧抗体以及不同厚度脑片对实验结果的影响，为科研实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级健康SD大鼠3只，雄性，体重140～160 g，购自北京斯贝福实验动物公司，动物合格证号：SCXK(京)2019-0010。本实验经中国中医科学院西苑医院动物伦理审查委员会批准。

1.2 脑缺血模型制备和BrdU给药实验大鼠以400 mg/kg腹腔注射4%水合氯醛麻醉，根据文献复制大鼠微球栓塞所致脑缺血模型[4]，从术后第一天开始腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每天注射1次，连续7天，最后一天注射后取材。

1.3 取材和标本处理大鼠麻醉后经腹主动脉取血，然后夹闭腹主动脉上方。先经左心室灌0.9%生理盐水至肝脏流出澄清液体，后改用4%PFA灌注至大鼠抽搐，全身僵直，即完成活体灌注固定。随后取出大鼠完整的脑组织于4%PFA中固定2 h，将脑组织浸入25%蔗糖溶液中，待2～3天组织沉淀后直接进行冷冻切片，收集不同厚度的脑片置于0.1 mol/L PB中，用于BrdU免疫荧光染色。

对于不灌注4%PFA的大鼠，经左心室灌注0.9%生理盐水至肝脏流出澄清液体，然后取出整脑，用模具从中间修成前后2块，分别包含侧脑室和海马，于4%PFA中4 ℃固定过夜，然后将脑组织浸入25%蔗糖中，后续操作同上。

1.4 BrdU免疫荧光染色依据实验需要对照《大鼠脑立体定位图谱》(第3版)[5]，取含有侧脑室和海马的脑冠状切面组织，厚约5 mm，在其周围滴加OCT，冷冻后进行冷冻切片。设置4个梯度厚度的脑片，分别为25、30、35和40 μm，收集脑片依次放入含有0.1 mol/L PB的6孔板中，采用漂片法进行BrdU免疫荧光染色。

将脑片置于0.1 mol/L PB中漂洗3次，每次5 min。切片经1 mol/L HCl(37 ℃孵育30 min)变性，用0.1 mol/L硼酸钠(pH 8.5)室温中和10 min，再经0.1 mol/L PB漂洗3次，每次5 min。3%山羊血清室温封闭30 min，BrdU单克隆抗体(稀释度1 ∶500) 4 ℃孵育过夜，0.1 mol/L PB中漂洗3次，每次5 min。再将脑片置于含有DAPI的对应二抗(稀释度1 ∶500)中，室温避光孵育90 min，随后于0.1 mol/L PB中避光清洗3次，每次5 min，再于0.02 mol/L PB中贴片，待切片略干但保持湿润状态下用抗荧光淬灭封片剂封固，并用透明指甲油将盖玻片边缘固封。采用Olympus荧光显微镜在10倍物镜下，观察BrdU细胞的表达。

2 结果

2.1 灌注PFA和不灌注PFA：侧脑室下区和海马齿状回BrdU细胞的表达BrdU呈核表达，在侧脑室下区和海马齿状回均有阳性。灌注PFA与不灌注PFA的大鼠脑片，在侧脑室下区和海马齿状回颗粒下区均可见BrdU阳性(图1)。同等条件下，其中不灌注PFA的大鼠脑片BrdU荧光信号更加清晰。

图1 A.脑缺血大鼠侧脑室下区BrdU呈阳性(新BrdU抗体，脑片厚40 μm)；B.脑缺血大鼠海马齿状回BrdU呈阳性(新BrdU抗体，脑片厚40 μm)

2.2 旧BrdU抗体：侧脑室下区和海马齿状回BrdU细胞的表达BrdU一抗4 ℃孵育过夜，第二天回收后于4 ℃保存，使用旧的BrdU抗体进行免疫荧光染色。结果显示：在大鼠脑组织的侧脑室下区和海马齿状回颗粒下区BrdU均明显阳性(图2)，提示回收利用BrdU抗体具有可行性。

图2 脑缺血大鼠侧脑室下区和海马齿状回BrdU呈阳性(不灌注PFA，脑片厚40 μm)

2.3 不同厚度的脑片:侧脑室下区BrdU细胞的表达脑组织冷冻切片厚25～50 μm，为寻找合适的切片厚度以增加切片数量，更好地适应实验需求，采用25、30和35 μm的大鼠脑片进行侧脑室下区BrdU免疫荧光染色。结果显示：25、30和35 μm的脑片BrdU均呈阳性(图3)。

图3 脑缺血大鼠侧脑室下区BrdU呈阳性(灌注PFA，新BrdU抗体)

3 讨论

BrdU是神经发生中反应增殖的重要指标，虽然石蜡切片免疫阳性物易被精确定位，但切片保存的时间和温度不当会导致组织抗原丢失，抗原反应活性降低常发生在石蜡切片上，前期实验发现石蜡切片BrdU染色效果并不理想。冷冻切片能较完整地保存抗原的免疫活性，冷冻切片可选用漂片法和贴片法进行免疫荧光染色，漂片法是指将切好的切片直接置于装有缓冲液的6孔板(或12孔板)中，清洗几次后，封闭，孵育一、二抗，最后裱在载玻片上，封固后进行观察；而贴片法需要将切好的切片，贴在载玻片上再进行下一步染色。漂片法与贴片法相比，其更能使抗体从两侧渗透，更有利于抗体与抗原充分反应，故本实验采取冷冻切片漂片法进行BrdU免疫荧光染色。

实验研究发现：(1)灌注PFA与不灌注PFA对BrdU荧光染色的影响：选用交联剂PFA对动物组织进行固定，有利于保持细胞结构，但交联会阻断抗体的结合能力，可能降低某些组分的抗原性，特别是固定时间较长或使用较高浓度的交联固定剂。与灌注PFA的大鼠相比，未进行PFA灌注的大鼠侧脑室下区和海马齿状回颗粒下区均可见BrdU明显表达，免疫荧光染色过程中切片完整，无脱片现象。(2)一抗回收对BrdU荧光染色的影响：漂片法浪费抗体，考虑到实验成本，在BrdU一抗4 ℃孵育过夜后，第二天将其回收到干净的离心管中置于4 ℃保存，结果显示使用旧BrdU抗体在脑组织的侧脑室下区和海马齿状回均有明显表达，提示回收利用BrdU抗体的可行性，同时BrdU抗体回收利用的次数以及保存期还需要进一步分析。(3)切片厚度对BrdU荧光染色的影响：脑组织冷冻厚切片(25～50 μm)可以观察由神经元胞体延伸而来的突触[6]，在以上的实验中均使用40 μm厚脑片，结果较为理想。由于侧脑室和海马所在部位的相应脑片厚度有限，为寻找合适的切片厚度以增加切片数量，更好地适应实验需求，本实验又探讨了不同厚度的脑片对BrdU染色的影响。前期实验表明20 μm脑片太薄，在漂洗、贴片过程中操作困难，易松散烂片，不易贴片。故本实验选择25、30和35 μm厚脑片进行侧脑室下区的BrdU免疫荧光染色，结果显示均有BrdU表达，其中脑片越厚，漂洗、挑片和贴片等操作相对容易，脑组织的完整性也更好。

总之，脑组织冷冻切片漂片法能较好地满足BrdU免疫荧光染色的需求，对于冷冻切片厚度的选择，脑组织前期处理是否灌注PFA及染色过程中BrdU回收利用的次数，可根据实验目的和需求、经济效益等进行综合考虑。