雷公藤多苷减轻干燥综合征模型小鼠炎性反应

刘珈言，梅 蓉，杨礼凤，赵文彬，韩成龙，周 慧，李二龙

(四川大学华西医院 皮肤性病科， 四川 成都 610041)

干燥综合征(Sjögren’s syndrome,sicca syndrome，SS)是自身免疫性疾病，发病部位多见于泪腺、唾液腺，表现为口舌发干、干燥性结膜炎，严重时导致内脏受损[1]。该病的发病率极高，发病机制也有待探索，其治疗也无根治方法，目前以对症治疗为主，多采用糖皮质激素、羟基氯喹、免疫抑制剂、生物制剂等药物，但是治疗效果并非尽如人意，甚至部分药物会产生较明显的副作用和异常反应，目前，发掘疗效好且异常反应小的药物是研究重点[2-3]。中医讲，SS主要伴有肝气郁结、脾肺失调等。雷公藤多苷(Tripterygiumwilfordiiglycosides,TWPS)是具有免疫调节功能的中药材，可用于滋阴生津，修复肝肾阴虚[4]。PI3K/Akt/eNOS信号通路与氧化应激，炎性反应，调节代谢紊乱密切相关[5]，因此，该信号通路可能是治疗干燥综合征的靶点。所以本文建立模型小鼠，经实验研究TWPS对SS型小鼠炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性小鼠84只，体质量(150±10)g[河南环宇康禾生物科技有限公司，许可证号：SCXK(豫)2020-0004]。于普通级环境下动物房饲养，鼠笼安静整洁，室内温度保持在(15～25)℃，空气流通干燥。

1.1.2 药物与试剂：雷公藤多苷(TWPS)(纯度>98%，经过水-氯仿及硅胶柱色谱的初步提纯，广州分析测试中心科力技术开发公司)；硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine sulfate，HCS)(上海源叶生物科技有限公司)；IL-6 ELISA试剂盒(北京润泽康生物科技有限公司)； IL-17 ELISA试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)；IgG ELISA试剂盒(上海群己生物科技有限公司)；兔源一抗(北京易科拜德科技有限公司)；羊抗兔二抗(广州鑫邦生物科技有限公司)；Wortmanin抑制剂(江苏碧云天生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠按照随机分数法分为对照组、干燥综合征模型组、硫酸羟氯喹组(20 mg/kg灌胃)、雷公藤多苷低、中和高剂量组(10、20、30 mg/kg 灌胃)、TWPS+Wortmanin(PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂)组，每组各12只。

1.2.2 唾液流率、饮水量的检测：待最后1次给药24 h后，测定每只小鼠1 d的唾液流率及饮水量。

1.2.3 全血黏度和血浆黏度的检测：取血5 mL，其中3 mL用于测定血液流变学指标。剩余血液静置后离心15 min，取上清液(血清)储于-80 ℃备用。

1.2.4 ELISA测定 IL-6、IL-17、IgG、eNOS：ELISA试剂盒测定血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS，所有实验操作均以说明书为准。

1.2.5 Western blot检测PI3K/Akt/eNOS通路蛋白：颌下腺组织提取总蛋白，电泳，转移，截取蛋白条，封闭，一抗4℃孵育过夜，漂洗3次，二抗孵育，漂洗后显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠模型唾液流率、饮水量

模型组较对照组唾液流率下降，饮水量增加(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高剂量组较模型组唾液流率增加，饮水量下降(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin组较雷公藤多苷低、中、高剂量组唾液流率下降，饮水量增加(P<0.05)(表1)。

表1 雷公藤多苷对干燥综合征小鼠唾液流率和 饮水量的影响

2.2 各组小鼠全血黏度和血浆黏度

模型组较对照组全血和血浆黏度增加(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高剂量组全血及血浆黏度较模型组降低(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin组全血及血浆黏度较雷公藤多苷低、中、高剂量组增加(P<0.05)(表2)。

表2 各组全血黏度和血浆黏度

2.3 各组小鼠血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS水平

模型组血清IL-6、IL-17、IgG水平较对照组增加，eNOS水平较对照组下降(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高剂量组血清IL-6、IL-17、IgG水平较模型组下降，eNOS水平较模型组增加(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin组血清IL-6、IL-17、IgG水平较雷公藤多苷低、中、高剂量组增加，eNOS水平较雷公藤多苷低、中、高剂量组下降(P<0.05)(表3)。

表3 各组血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS水平Table 3 Levels of IL-6, IL-17, IgG and eNOS in serum of each

2.4 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白

模型组较对照组p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平下降(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高剂量组较模型组p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平增加(P<0.05)；雷公藤多苷+Wortmanin组较雷公藤多苷低、中、高剂量组p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS水平下降(P<0.05)(图1，表4)。

图1 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白Fig 1 Proteins of PI3K/Akt/eNOS pathway

表4 PI3K/Akt/eNOS通路蛋白Table 4 PI3K/Akt/eNOS pathway

3 讨论

干燥综合征(SS)是弥漫性结缔组织病，累及泪腺、唾液腺等外分泌腺体[6-7]，伴有口腔及角膜干燥，严重时会导致内脏受损[8]。SS的病因复杂，受环境、遗传等内外因干扰。研究发现，SS患者免疫细胞出现异常改变，炎性因子免疫增加，炎性细胞扩增至影响到其他组织和器官，迸发炎性反应，损伤腺体和器官[9]。雷公藤多苷(TWPS)是具有免疫调节功能的中药材，可滋阴生津，修复肝肾阴虚[10]、缓解炎性反应，改善机体免疫等。本实验分析TWPS对SS模型小鼠炎性作用的影响并探索其作用机制。

本实验建立的SS小鼠模型完成后，小鼠唾液流率下降，饮水量增加，血清IL-6、IL-17增加证明模型成功且病情进一步发展[11]。中医讲，SS主要伴有肝气郁结、脾肺失调等，所以治疗应该以养肝润肺、培元理气等为主[12]。研究表明，TWPS可作为干燥综合征的治疗药物，疗效明显[13]，并且对多种内脏器官的急性损伤有缓解作用，能够调控体液免疫，抑制Th细胞活性，达到间接控制β淋巴细胞的作用，减弱抗体效价[14-15]。磷酸化激活PI3K/Akt/eNOS信号通路可以调控炎性反应，使血液中一氧化碳水平升高，从而抑制炎性反应。实验证明，模型组小鼠的唾液流率、eNOS水平下降，而TWPS能够使小鼠的唾液流率、eNOS水平增加，并且降低小鼠饮水量、全血黏度、血浆黏度、血清IL-6、IL-17、IgG水平，TWPS对SS小鼠的作用与剂量和反应时间有关，在无毒性反应剂量内，TWPS剂量越高，持续时间越长，作用效果越好，为证实雷公藤多苷通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路改善SS鼠的症状，设置了TWPS+Wortmanin组，其中Wortmanin为PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂，经过实验对比该组小鼠唾液流率、饮水量、全血黏度高切、全血黏度低切、血浆黏度、血清IL-6、IL-17、IgG、eNOS水平及PI3K/Akt/eNOS通路蛋白发现，指标数据与模型组小鼠差异无统计学意义，表明在通路抑制剂的影响下，即使是高剂量TWPS对SS模型小鼠也无治疗效果，这证明TWPS对PI3K/Akt/eNOS信号通路有一定的调节控制作用。

TWPS能够改善SS小鼠血液黏度及口干等症状，这与磷酸化激活PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关，但是否有其他的机制还需要进一步实验探索。本研究局限性在于只通过动物模型探索TWPS对SS的疗效，至于在人类机体中是否有同样效果还需深入研究。