利用微滴数字PCR进行BRAF V600E突变与PD-L1表达的相关性分析

段芳芳，樊金星，易丽君，徐红艳，杨文萍，杜香平，李 红

朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis, LCH)是一种罕见的血液系统肿瘤，以朗格汉斯细胞异常克隆性增生为特征。儿童期发病率为4.1/100万，婴儿期发病率可高达15.3/100万[1]。接受联合化疗方案的患者5年复发率高达30%～40%[2]，BRAF V600E突变引起的RAF/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路异常活化是致病的主要原因[3]，应用BRAF V600特异性抑制剂(维罗非尼和达拉非尼)进行靶向治疗，对婴儿期伴有重要器官损伤的患者收效甚微[4-6]。有研究显示LCH微环境中也存在T细胞耗竭现象[7]，PD-1/PD-L1免疫检查点是导致T细胞功能丧失的主要因素，从而逃避免疫系统的攻击[8-11]。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，可以逆转T细胞功能的耗竭[12]。本实验重点分析ddPCR技术检测LCH组织中BRAF V600E突变的效果，旨在探讨儿童LCH组织中BRAF V600E突变与PD-L1表达的相关性，为联合药物应用靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2012年1月～2020年6月南昌大学附属儿童医院/江西省儿童医院诊治的100例LCH患儿，诊断及疗效标准依照《儿科学》及《血液病诊断及疗效标准》[13-14]。选取不超过3年且保存完好的石蜡组织切片34例。

1.2 主要试剂免疫组化抗体购自福州迈新生物公司。石蜡包埋切片提取DNA试剂盒购自QIAGEN公司(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，货号56404)。检测BRAF V600E突变试剂盒购自厦门艾德生物公司(货号8.0120301X024A)。石蜡包埋切片提取RNA试剂盒购自OMEGA公司(EZNA FFPE RNA Kit，货号R6954-01)。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色，免疫组化染色采用EnVision两步法，所用抗体包括CD1a、Langerin、S-100、CD20、CD68、CD3、Ki-67(均购自福州迈新公司)，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3.2PCR 提取石蜡包埋切片DNA，使用qRT-PCR法定量BRAF V600E突变水平，提取切片组织RNA，并用微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法进行BRAF V600E绝对定量分析，所用引物和探针序列如下。BRAF-F：5′-TACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA-3′，BRAF-R：5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′；探针：BRAF-V600E-wt 5′-VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-NFQ-3′，BRAF-V600E-mt 5′-FAM-TAGCTACAGAGAAATC-NFQ-3′。

1.3.3PD-L1共表达分析 在34例LCH样本中选取保存完好且适宜行PD-L1免疫组化染色分析的石蜡切片27例，使用Image J软件进行光密度值(optical density, OD)分析PD-L1蛋白表达，PD-L1表达越多DAB着色越深，OD值就越大。为校正面积因素对OD值结果的误差影响，本实验均采用平均光密度(average optical density, AOD)值分析。

1.4 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。一致性分析使用Kappa一致性检验和配对χ2检验，双变量相关性检验采用Pearson检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征34例LCH患儿中男童18例，女童16例，男女比为1.12 ∶1，年龄28天～1岁者1例，1～3岁者7例，3～9岁者22例，大于9岁者8例，平均发病年龄5岁。单系统性LCH 19例，多系统性LCH 15例，多数患儿伴支气管肺炎(表1)。

表1 34例LCH临床特征及BRAF V600E突变检测结果

2.2 病理检查本组皮肤活检标本8例，淋巴结活检标本3例，骨组织活检标本21例，头部包块活检标本2例。所选标本免疫组化检测结果示CD1a(图1A)、Langerin(图1B)、S-100(图1C)阳性率为100%，Ki-67增殖指数为5%～40%。

ABC

2.3 PCR检测qRT-PCR检测显示，34例LCH组织中76.47%(26/34)病例检测出BRAF V600E突变(图2A)；ddPCR检测BRAF V600E突变率为82.35%(28/34)(图2B、C)；两种方法检测结果一致率为94.12%(32/34)，且一致性高(Kappa=0.82，P<0.001)。本实验中男童和女童BRAF V600E突变分别占83%和69%；在病变部位为骨骼受损的LCH患儿中，BRAF V600E突变占62.5%；在BRAF V600E阳性组中男女比为15 ∶11，皮肤损伤占26.9%，骨损伤占53.8%，其中股骨损伤占26.9%(左侧股骨占15.4%，右侧股骨占11.5%)(表1)。

图2 qRT-PCR法与ddPCR法检测BRAF V600E基因表达图：A.qRT-PCR检测LCH BRAF V600E阳性图谱；B.ddPCR检测LCH BRAF V600E阳性FAM通道图谱；C.ddPCR检测LCH BRAF V600E阳性VIC通道图谱

2.4 BRAF V600E与PD-L1共表达的相关性分析27例PD-L1免疫组化平均AOD值为0.45～0.72；将PD-L1的表达量与ddPCR的BRAF V600E阳性微滴数进行联合分析，结果显示BRAF V600E阴性组中有2例PD-L1高表达，BRAF V600E阳性组中有21例PD-L1高表达，差异有显著性(P<0.01)。随着BRAF V600E阳性微滴数比例的增加，PD-L1表达呈上调趋势，Pearson双变量相关性检测相关系数为0.44，两者呈现一定的相关性且差异有显著性(P<0.05，图3)。

图3 BRAF V600E与PD-L1共表达的相关性：A.BRAF V600E阳性微滴比值与PD-L1表达的相关性；B.BRAF V600E阴性和阳性表达组中PD-L1的表达

3 讨论

34例LCH患儿多见于皮肤组织损害和骨损害；本实验中BRAF V600E突变比例在男童和女童中分别为83%和69%；在病变部位为骨骼受损的LCH患儿中，BRAF V600E突变占62.5%；在BRAF V600E阳性组中男女比为15 ∶11，皮肤损伤占26.9%，骨损伤占53.8%，其中股骨损伤占26.9%(左侧股骨占15.4%，右侧股骨占11.5%)。BRAF V600E突变与病变部位皮肤、骨骼之间差异均无显著性(P>0.05)；患儿性别与LCH损害病变部位皮肤、骨骼差异均无显著性(P>0.05)。本实验中BRAF V600E突变与LCH患者发病年龄、性别、病变部位无关，与文献报道一致[15]，但LCH发病率低，本实验选取样本量少，后续还需收集更多病例进一步分析。据文献报道25%～70%的LCH是BRAF V600E突变所引起[3, 16-18]，不排除其他基因突变导致LCH的可能，未来需要更多样品的特异性筛查基因，完善LCH基因变异谱库。

PD-L1表达水平受多种因素调控[19]，BRAF V600E与PD-L1表达的相关性存在争议。有文献报道儿童低级别恶性胶质瘤中BRAF V600E突变与PD-L1表达无相关性[20]，而在皮肤黑色素瘤[21]及结肠癌[22]中两者呈正相关。儿童LCH中BRAF V600E与PD-L1表达的相关性尚未见文献报道。本实验证实LCH中BRAF V600E突变与PD-L1表达呈正相关。BRAF基因是MAPK通路的成员之一，临床上单层次使用靶向药物BRAF V600E抑制剂具有很多不确定性[7,23]，联合应用免疫疗法可能对减少副作用、提高治愈率、降低复发具有重要意义，未来尚需要大规模的临床研究来证实。

携带BRAF V600E的LCH患者复发或低痊愈率的可能性约是未突变患者的2倍[24]，且BRAF V600E携带者具有更高的中枢神经系统疾病(central nervous system diseases, CND)患病风险[25]。BRAF V600E突变是预测LCH预后及CND是否受累的重要独立分子标志物，是非常有价值的预测参数[3]。如何从组织或者外周血中快速有效且灵敏的检出BRAF V600E突变非常关键，ddPCR是基于单分子PCR法来进行计数的核酸定量方法，灵敏度高于qRT-PCR技术[26-27]，ddPCR技术的出现为精准诊断提供了解决方案。本实验结果显示，ddPCR表现出更高的检测灵敏度和可靠性，其中2例qRT-PCR检测阴性的样本均可用ddPCR检测，显示ddPCR相比传统的qRT-PCR技术可提供更稳定、更高灵敏度的微小残留病灶检测结果，后续我们将进一步探究ddPCR技术在儿童肿瘤微小残留病灶监控中的应用价值，协助临床医师更早地发现疾病的复发。