慢性萎缩性胃炎与浅表性胃炎患者舌象特点及其微生物群落结构分析

王亚楠，袁莉，汪莉，徐志远，阮华，程向东，董昌武

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230000；2.中国科学院大学附属肿瘤医院，浙江 杭州 310022；3.杭州市余杭区中医院，浙江 杭州 310022

慢性胃炎（chronic gastritis，CG）是由多种因素引起的黏膜炎症性疾病，临床表现以上腹部疼痛、胃脘部胀满、反酸嘈杂为主，且易反复发作，严重影响患者的生活质量。CG属中医学“胃脘痛”“痞满”“泛酸”等范畴。胃炎的发展是一个多步骤、多因素的过程，可分为浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生和异型增生。研究表明，胃炎的发展会增加患胃癌的风险。目前，临床主要通过胃镜和病理组织学检查进行胃炎诊断，中医通过望舌可以了解机体内在气血盛衰与阴阳虚实，《临症验舌法》所谓“凡内外杂症，无一不呈其形，着其色于舌”，故在胃炎防治中可通过观察舌象进行疾病的监测和控制。

舌苔微生物是口腔菌群的重要组成部分，舌苔菌群的变化可以为疾病的诊断和治疗提供帮助。本研究采用横断面研究方法，通过中医舌诊AI开放平台系统对167例CG患者的舌象进行分析，同时采用高通量测序技术对样本中的16S rDNA基因进行测序分析，以研究舌苔微生物群。

1 资料与方法

1.1 病例来源

选取2021年1－9月杭州市余杭区中医院消化内科经电子内镜和病理组织学检查确诊的慢性萎缩性胃炎（CAG）患者86例、慢性浅表性胃炎（CSG）患者81例，同时收集其舌象图片、舌苔样本及病历资料。本研究经中国科学院大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准（IRB-2019-56）。

1.2 诊断标准

参照《中国慢性胃炎共识意见（2017年，上海）》，CG的内镜诊断系指肉眼或特殊成像方法所见的黏膜炎性变化，需与病理学检查结果结合做出最终判断。CSG患者内镜结果显示斑点和条状红斑，黏膜粗糙不均匀，出血点，糜烂和胆汁反流。CAG患者内镜结果显示胃黏膜以白色为主，褶皱变平，黏膜血管暴露，存在黏膜结节，同时，病理活检显示固有腺体萎缩。

1.3 纳入标准

①年龄40～80岁，性别不限；②无明显口腔疾病；③3个月内未使用过影响舌面颜色的药物；④新诊断且未经治疗；⑤有完整的舌面图像（入组时舌象收集完成）；⑥患者均对本研究知情，并签署知情同意书。

1.4 排除标准

①无法耐受胃镜检查；②合并胃癌、胃出血等肠道疾病；③合并严重脏器疾病及精神类疾病，语言障碍不能沟通；④哺乳期、孕期妇女；⑤不会伸舌或伸舌困难者；⑥DNA提取量不足，无法进行测序工作。

1.5 舌象采集与分析

1.5.1 采集时间与方法

于清晨患者未进食状态下采集舌象。拍摄时嘱患者放松自然地伸出舌头，保持舌面展平、舌体放松、舌尖朝下的状态。

1.5.2 设备和软件

采用配备高清摄像头的移动智能手机，支持自然光源拍摄。采用安徽中医药大学与合肥云诊信息科技有限公司联合研发的中医舌诊AI开放平台系统，通过捕捉舌象，自动提取特征，以辅助中医诊断。系统的价值取决于其校准亮度和颜色的能力，以补偿来自光源和成像硬件的强度和色温的变化。舌体区域图像被自动分割以获得相关的舌体特征。系统提取中医舌诊的主要特征，进一步生成有关长度、面积、湿度和舌部特征数量的详细信息。结合人工判断，形成最终分类，提取5类舌象。①舌色：淡红舌、红舌、绛舌；②苔色：白色、黄色；③苔的厚薄：厚、薄、剥落；④苔的腐腻：腐、腻、正常；⑤舌质润燥：即唾液面积占舌体总面积的比例（燥或润）。

1.6 舌苔菌群分布

1.6.1 主要试剂与仪器

Pusion Hot start flex 2X Master Mix，上海仪涛生物仪器有限公司（M0536L）；DL2000 DNA Maker，Takara（3427A）；Stool DNA Kit（200），OMEGA bio-tek（D4015-02）；AMPure XT beads，Beckman（A63880）；Gene colour，北京 金博益（GBY-1）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（500次），Invitrogen，Life technologies（Q32854）；生工50×TAE Buffer，上海 生 工（B548101-500）；Biowest Agarose G-10，BIOWEST（111860）。

常温离心机（Eppendorf Centrifuge 5424），旋涡震荡仪（华利达，WH-861 Vortex Shaker），三温三控恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司，DK-8D），PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司，A200基因扩增仪），电泳仪（Tanon天能，EPS300），凝胶成像仪（Tanon-2500），超低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技有限责任公司，DW-HL388）。

1.6.2 样本采集

随机收集CAG、CSG各30例舌苔样本，取样前漱口，使用一次性无菌拭子刮取患者舌面3～5次，将其置于1.5 mL舌苔样本收集小管（含保存液）中，12000 r/min离心5 min，去除上清液，置于超低温冷冻储存箱中备用。

1.6.3 DNA抽取与PCR扩增

对样本舌苔进行微生物组总DNA提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。利用细菌16S rDNA基因V3～V4可变区进行PCR扩增，引物序列：341F（5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3"）805R（5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3"），PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳确证，PCR产物由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）纯化，Qubit（Invitrogen，USA）定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量分别在Agilent2100生物分析仪（Agilent，美国）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒上进行评估，样品在Illumina NovaSeq平台上进行测序。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 2组一般资料比较

CAG组、CSG组性别、吸烟、饮酒比较差异无统计学意义（＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 CAG组和CSG组一般资料比较

2.2 2组舌象比较

舌色方面，CAG患者以红舌为主，CSG患者以淡红舌为主；苔色方面，CAG患者以黄苔为主，CSG患者白苔为主；苔的厚薄方面，CAG患者厚苔居多，CSG患者薄苔较多；苔的腐腻方面，CAG患者以腻苔为主，CSG患者以正常为主；舌质润燥方面，2组均以润为主，CAG较CSG患者燥舌增加。2组舌色、苔色、苔的厚薄及腐腻、舌质润燥差异有统计学意义（＜0.01）。见表2。

表2 CAG组和CSG组舌象比较［例（%）］

2.3 2组舌苔高通量测序数据比较

对原始下机数据进行双端拼接、质量控制、嵌合体过滤后，进行高质量数据统计，见表3。2组在有效片段数（=0.124）、片段长度（=0.525）、Q20%（=0.220）、Q30%（=0.160）、GC%（=0.695）等方面比较差异无统计学意义。

表3 舌苔高通量测序2组比较（xˉ±s，n=30）

2.4 2组舌苔菌群Alpha多样性比较

Alpha多样性是指一个特定环境或生态系统内的多样性，主要反映物种丰富度和均匀度及测序深度。Alpha多 样 性 主 要 通 过Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson等指数反映丰富度和均匀性。Chao1、Observed_species指数主要反映样本的物种丰富度信息；Goods_coverage反映样本的低丰度feature覆盖情况；Simpson/Shannon主要综合体现物种的丰富度（Richness）和均匀度（Eveness）。由图1可知，CAG与CSG舌苔微生物Alpha多样性指数差异有统计学意义（＜0.05），说明2组舌苔微生物群落差异显著，CAG组的菌群多样性明显高于CSG组。

图1 CAG组和CSG组舌苔菌群多样性比较

2.5 2组舌苔菌群组成比较

Venn分析可知，2组共有菌群1213种，其中CAG组特有菌群1880种，CSG组特有菌群1264种。根据物种丰度表和物种注释表，选取丰度最高的30个物种分类，将每个分组的相对丰度以堆叠柱状图形式展现，从而比较样品丰度。结果显示，在门水平，菌群分布以拟杆菌门、变形杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门为主，其中CAG组梭杆菌门的分布高于CSG组，拟杆菌门、变形杆菌门的分布低于CSG组，见图2a；在属水平，菌群分布以奈瑟菌属、普雷沃氏菌属_7、嗜血杆菌属、卟啉单胞菌属为主，其中CAG组奈瑟菌属分布低于CSG组，卟啉单胞菌属分布高于CSG组，见图2b。

图2 CAG组与CSG组舌苔菌群平均相对丰度

2.6 2组舌苔菌群显著性差异分析

根据样品物种丰度表，采用Mann-Whitney检验（适用于有生物学重复2组样品差异比较）进行物种差异检验。在门水平影响分组的2种菌是梭杆菌门、Candidatus_Saccharibacteria（见图3a），在属水平影响分组的18种菌是链杆菌属、普雷沃氏菌属ceae_UCG-001、Ruminococcus_gnavus_group、、等（见图3b）。

图3 CAG组与CSG组舌苔菌群显著性差异分析

2.7 2组舌苔菌群LEfSe差异分析

LEfSe（LDA effect size）分析主要目的是比较不同组间在丰度上有显著差异的物种，能够更加直观展现组间所有层级的差异物种。图4显示，2组门水平的梭杆菌门、属水平的有显著差异，且在CAG组中的丰度更高。

图4 CAG组与CSG组舌苔菌群LEfSe差异分析

2.8 舌苔菌群相关性网络

相关性网络图（SparCC）是通过计算属水平丰度top30的微生物丰度，获得两两优势菌群间的相关性及显著性（值），再用相关性绘制网络图。由图5可见，普雷沃氏菌属_7与普雷沃氏菌属、韦荣氏球菌属呈正相关，与卟啉单胞菌属、嗜血杆菌属呈负相关，嗜血杆菌属与卟啉单胞菌属、奈瑟菌属呈正相关。与其他菌的数目关联最多的细菌是普雷沃氏菌属_7、嗜血杆菌属。

图5 CAG组与CSG组属水平丰度top30的舌苔菌群相关性网络

3 讨论

舌象可反映机体内在气血盛衰与阴阳虚实，近年来舌诊研究在客观化、标准化方面取得一定进步。目前大多数学者认同正常胃黏膜-CSG-CAG-癌前病变-胃癌的发展模式，认为CSG病情程度较CAG轻。中医学认为，正常人多表现为淡红舌、薄白苔，病情越发展舌象变化越明显。本研究中，我们发现CAG患者舌象以红舌、黄苔、厚苔、腻苔为主，CSG患者以淡红舌、白苔、薄苔为主。《伤寒舌鉴》有“夫红舌者，伏热内蓄于心胃，自里而达于表也”。CAG患者舌色以红为主，认为内有热象。西医学认为舌色发红多见于感染发热患者或慢性消耗性患者。《辨舌指南》有“黄苔主里……全舌黄苔者，脏腑俱热”。研究发现，苔色受细胞生长分化和溶解退化间动态平衡影响。研究发现，舌苔随细胞代谢速率改变产生敏感变化，体现在舌苔厚薄与细胞生长分化和溶解退化的动态改变。《温热经纬》有“舌苔厚而有根，浊邪瘀结”。以上均表明中医舌诊可为疾病提供潜在的筛查和早期诊断方法，欲获得更科学的结论仍需调查更大样本量及更精确的生物组学证据。

解剖学认为，舌与消化系统密切相关。脱落上皮、唾液、食物碎屑、透出的白细胞等共同组成舌苔，饮食习惯、生活方式和微生态环境等多种因素影响舌苔变化。1984年，Marshall等发现胃幽门螺杆菌在CG中发挥重要作用，表明细菌是导致胃炎的因素。但既往研究发现，约25%的CG患者没有感染幽门螺杆菌，表明其他能够引起炎症的细菌参与了该过程。此后，众多研究者证实了除幽门螺杆菌以外的细菌在胃病中的作用。现代研究表明，16S rDNA基因的高通量测序在鉴定口腔微生物群中的综合细菌方面发挥着至关重要的作用，目前已有研究者利用该技术调查了口腔细菌群落与胃炎发展的潜在关系。本研究对CAG组和CSG组舌苔微生物菌群进行检测和分析，以探讨特定图像产生的深层原因，发现2组样本中尽管存在大量相同物种，但其微生物组成、多样性和功能存在一定差异。

本研究与既往研究结果一致，认为拟杆菌门、变形杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门是鉴定出的4个最具优势的门。在属水平上，奈瑟菌属、普雷沃氏菌属_7是最丰富的属。充分说明这些菌群在CG人群的舌苔微生物中占据重要地位，是构成口腔中舌苔微生物群落结构的最基础成分。此外，门水平上，CAG组梭杆菌门的分布高于CSG组，梭杆菌门是口腔微生物群的常见成员。有研究发现梭杆菌属m能够引起炎症，更有学者发现梭杆菌属m可能与结直肠癌有关。拟杆菌门属于口腔正常菌群，而拟杆菌门在CAG组的分布低于CSG组，证明梭杆菌属m、拟杆菌门可能与胃炎的病变程度有关。属水平上，CAG组卟啉单胞菌属分布高于CSG组。卟啉单胞菌属已被证明具有致癌潜力，可抑制细胞凋亡，激活细胞增殖，促进细胞入侵，诱导慢性炎症，并直接产生致癌物。奈瑟菌属分布低于CSG组，本结果与既往研究不一致，考虑舌苔菌群的组成和与疾病症状有关，如CAG患者症状表现以吐酸、嗳气为主，而CSG患者症状不明显，这些症状表现都会影响舌苔菌群变化。LEfSe差异分析发现，梭杆菌门在2组差异有统计学意义，且在CAG组的丰度更高，表明CAG患者舌苔菌群结构更加丰富且存在较多优势菌群，口腔菌群失调程度加重。这些菌属的改变提示CG的发展可能与炎性因子有关，由于菌群改变，导致代谢物甚至一系列全身系统变化。虽然目前研究缺乏关于特定细菌种类在CG发生发展过程中的确切致炎机制，但在CG患者中观察到的微生物区系变化丰富了对口腔细菌与CG相关性的认识。

门、属水平的特定微生物可能为舌诊研究指明方向，但仍需更多研究确认特定微生物与舌质和舌苔图像特征间的关系。或可通过观察舌象、调整舌苔菌群的方式对胃肠道进行干预和调控，从而干预CG疾病的发展进程。此外，如何将中医舌诊与开发新的生物标志物相结合，用以预测疾病的转归、进行辨证论治也是需要关注的问题。