重金属对畜禽养殖土壤中抗生素耐药菌影响的研究

熊 爽, 张 丽,2, 黄益嘉, 彭丽芳, 邵欢欢, 勾 洵*

(1. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101; 2. 内江卫生与健康职业学院 基础医学部, 四川 内江 641100)

我国作为畜禽养殖大国,抗生素被大规模地用于预防、治疗禽畜疾病和促进禽畜生长,每年被应用于畜禽养殖的抗生素约占我国抗生素使用总量的46.1%[1-3].但相关研究表明,一半以上进入到动物体内的抗生素因无法被吸收而以原药或粪便、尿液等代谢物的形式排出体外.这些抗生素逐渐进入生态环境后,很难完全得到转化或降解[4-5].随着使用时间的增加,一些微生物产生抗生素抗性基因,而后病原菌对抗生素的抗性也随之增加,环境细菌的耐药性增加,给人类健康带来威胁[6-7].另一方面,微量金属元素作为饲料添加剂被养殖场使用,畜禽粪便中的重金属残留也是养殖场土壤中重金属污染的主要来源[8].这些重金属污染不仅严重危害畜禽的健康、食品的安全,也对周围土壤环境和地下水循环造成威胁.高浓度的重金属污染被证实与抗生素抗性基因的丰度密切相关,细菌耐药性水平随着重金属污染水平增加而增加.畜禽养殖场及周围土壤环境受到重金属和抗生素的复合污染,对环境细菌的抗生素抗性水平表现出交互影响,促进或抑制细菌抗生素抗性的污染,但具体影响尚不清楚,相关研究较少,且缺乏系统性[9-10].

本研究从某畜禽养殖场土壤中筛选具有抗生素抗性的菌株,研究在抗生素(庆大霉素、阿莫西林、头孢拉定、四环素)浓度一定情况下,不同浓度梯度的典型重金属(Cu2+、Cr6+、Cd2+)对其抗生素抗性水平的影响,为研究重金属和抗生素复合污染对畜禽养殖生态环境的影响及利用微生物法进行防治提供科学支撑[11].

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品 样品采集于成都市某废弃畜禽养殖场土壤,质控菌株分别为铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠杆菌ATCC 35218.

1.1.2主要仪器 SW-CJ-2F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);H1850R高速冷冻台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);HH-S6电子恒温水浴锅(江苏金坛医疗仪器厂);GHP-9050隔水式培养箱(上海和羽电子科技有限公司);UV1000紫外可见分光分析仪(上海天美科学仪器有限公司);JD200-3电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);PHS-25B数字酸度计(上海大普仪器有限公司);S1000 PCR仪(Bio-Rad);酶标仪(SpectraMax i3x);微型离心机(杭州奥盛仪器有限公司,Mini-6K);恒温震荡机(SPH-200B);水平电泳槽(Bio-Rad).

1.1.3主要试剂及培养基 培养基:LB液体培养基,基础培养基,MH琼脂培养基,重金属离子实验培养基等.

重金属标准液:配制质量浓度为104mg/L的CdCl2·2.5H2O、CuSO4·5H2O和K2Cr2O7重金属标准溶液,用于调节选择培养基中重金属的浓度.

药敏纸片:头孢拉定(30 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、四环素(30 μg/片),购于杭州微生物试剂有限公司.

1.2 方法

1.2.1土壤菌的筛选与分离纯化 称取10 g土壤溶于90 mL无菌水,20 ℃振荡培养24 h.向99 mL的LB液体培养基中加入1 mL土壤培养液的上清液,30 ℃、150 r/min振荡培养36 h.培养基平板上均匀涂布50 μL稀释菌液,菌液干燥后倒置于30 ℃生化培养箱中.挑取形态不一样的单菌落,转移至液体基础培养基中，30 ℃、150 r/min振荡培养24 h.经划线分离后,在30 ℃生化培养箱中过夜培养.甘油管藏保存分离出的单菌落.

1.2.2标准曲线的测定及绘制 按照麦氏比浊管的不同比浊管配制相应浊度的硫酸钡溶液,分光光度计测量625 nm时,空白、0.5、1、2、3和4时各个浊度的硫酸钡溶液的光吸收值,每个样测3个平行样,制作标准曲线.

菌株平板划线接种后,在37 ℃生化培养箱中培养24 h.挑取单菌落接种于液体培养基中,37 ℃、150 r/min震荡培养18 h.按照1%的接种量,接种到液体基础培养基中,37 ℃振荡培养至第2、4、8 h时,分别测定625 nm时光吸收值,得到菌株的生长曲线,以确定1.5×108cfu·mL-1的悬菌液合适的培养时间,用于重金属最小抑制浓度(Minimal Inhibition Concentration,MIC)测定及抗生素抗性研究.

1.2.3抗性菌株的筛选及鉴定 采用K-B纸片扩散法做抗生素耐药试验[12].初筛过程筛选出10株具有抗生素抗性的菌.移取比浊后的100 μL悬菌液,均匀涂布到MH试验培养基上,放置15 min后,将药敏纸片贴在培养基表面,各纸片中心距离大于24 mm,平板边缘到纸片边缘的距离大于15 mm.每个平板贴3片相同的抗生素纸片作为对照,静置18 min后37 ℃培养18 h,测量抑菌圈直径.

1.2.416S rDNA序列测定及系统发育分析 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取模板DNA,采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增.PCR反应体系(25 μL):2×Taq PCR Master-mix KT20112.5 μL,27F 1μL,1492R 1μL,ddH2O 7.5 μL,模版DNA3 μL.

引物序列27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′.

PCR程序:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,进行35个循环,72 ℃终延伸10 min.

PCR产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序,后将基因序列提交GenBank,采用BLAST分析所测序列同源性,通过EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net/)对该菌株进行初步的菌株确定,并利用MEGA 5.0构建菌株系统进化树.

1.2.5重金属最小抑制浓度的测定 在基础培养基中分别添加不同量的重金属标准液,Cd2+的质量浓度变化范围为0～200 mg·L-1，Cr6+的质量浓度变化范围为0～400 mg·L-1，Cu2+的质量浓度变化范围为0～1 600 mg·L-1,将100 μL菌悬液涂布到各培养基上,37 ℃培养24 h.记录抑制菌株生长的最低重金属浓度,即为重金属最小抑制浓度MIC.

1.2.6重金属与抗生素交叉抗性的研究 本试验设计在抗生素浓度一定时(庆大霉素10 μg/片、阿莫西林20 μg/片、头孢拉定30 μg/片、四环素30 μg/片),不同浓度的重金属对菌株的抗生素抗性的影响.根据3种重金属的MIC值,分别添加一定量的重金属标准液至MH培养基中,凝固后取100 μL菌悬液滴加至含重金属的试验培养基上,涂布均匀.15 min后,取药敏纸片贴在涂好菌液的培养基上,每个平板上贴3片,37 ℃培养18 h,测定抑菌圈大小，并计算抑菌圈的直径变化率.

1.2.7统计分析 利用SPSS 20.0对数据进行单变量多因素方差分析(P<0.05).通过加入重金属前后的抑菌圈直径比值计算抑菌圈直径变化率.利用origin 8.5绘制不同浓度Cd2+、Cu2+、Cr6+对抗生素抗性水平影响的柱形图.

2 结果与分析

2.1 抗性菌株的筛选和鉴定实验前期共筛选出38种菌,对其进行抗性研究,其中编号10-③的菌对4种抗生素抗性相对较高,命名为C32.革兰氏染色阴性，呈杆状,单个或成对.生化性质鉴定结果见表1.菌落为圆形,灰白色,表面湿润,有光泽,不透明,边缘不规则,较黏稠.易挑取,中央部位比边缘颜色深.偶尔可见黏液或粗糙型(见图1).

表1 C32的生化试验结果

图1 C32的形态观察

注:C32在基础培养基平板中培养1天

2.2 C32的16S rDNA序列测定及系统发育分析使用NCBI数据库中的BLAST软件对C32的16S rDNA序列进行比对分析,结果表明C32菌株与Citrobacterfreundiistrain NBRC 12681 (NR 113596.1)和Citrobacterfreundiistrain JCM 1657(NR 113340.1)的相似度为99.71%,通过EzBioCloud网站比对分析发现C32最可能是Citrobacterfreundii菌株,同时系统进化树结果也发现C32与C.freundiistrain NBRC 12681和C.freundiistrain JCM 1657亲缘关系最近,因此,C32菌株很有可能是Citrobacterfreundii菌株(见图2).

图2 菌株C32的16S rDNA系统进化树

2.3 重金属最小抑制浓度的确定测得C32对Cd2+、Cr6+、Cu2+的MIC分别为125、125和1 600 mg/L,并在此基础上研究重金属对其抗生素抗性的影响.根据C32的重金属MIC值分别设置3种重金属的浓度梯度,Cd2+和Cr6+的质量浓度梯度设置为0、0.1、2、10、50、100和150 mg/L,Cu2+的质量浓度梯度设置为0、0.1、2、10、50、150、300、500、1 000、1 200、1 400和1 600 mg/L.

2.4 测定C32对重金属与抗生素的交叉抗性

2.4.1C32抗生素抗性的测定 抗性菌的药敏实验结果见表2.由表2可知,C32对阿莫西林、四环素和对头孢拉定表现耐药,而对庆大霉素表现敏感.

表2 C32的抗生素敏感性

2.4.2重金属种类和浓度与抗生素抗性的相关性分析 单变量多因素方差分析结果显示F种类=1 728.803,P种类<0.05,表明重金属种类对抑菌圈直径的变化影响显著;另外F浓度=26.509,P浓度<0.05,也表明重金属浓度对抑菌圈直径的变化影响显著.此外,不同类型的二维交互效应对抑菌圈直径也有显著的影响(P<0.05),重金属浓度×重金属种类×抗生素种类之间的三维交互效应同样显著影响抑菌圈直径(F=14.023,P<0.05),说明重金属与抗生素之间具有交互作用,同时交互效应的影响也表明重金属胁迫对菌株抗生素抗性水平有一定的影响(表3).

表3 主效应方差分析

2.4.3重金属浓度对抗生素抗性的影响 1) Cd2+浓度对C32的抗生素的抗性影响.图3A显示,与阿莫西林共存时,随着Cd2+浓度升高,抑菌圈直径由12.35 mm(0.1 mg/L)逐渐增大到19.59 mm(100 mg/L),表明随Cd2+浓度的升高,协同杀菌作用逐渐增强;头孢拉定与Cd2+共存时,抑菌圈直径的相对变化率依次为1.12%(0.1 mg/L)、-16.80%(2 mg/L)、-19.92%(10 mg/L)、-13.84%(50 mg/L)、52.16%(100 mg/L),结果表明低浓度Cd2+与头孢拉定表现协同抗性作用,较高浓度Cd2+与头孢拉定表现协同杀菌作用;四环素与Cd2+共存时,抑菌圈直径变化率为-6.67%～16.06%,表明Cd2+存在时抑菌圈直径变化率很小,但抑菌作用随Cd2+浓度的升高而增强;庆大霉素与Cd2+共存时,抑菌圈的直径变化率为4.89%～22.58%,结果表明Cd2+存在时表现协同杀菌作用,且抑菌能力随Cd2+浓度的升高而升高.

A

2) Cr6+浓度对C32的抗生素的抗性影响.图3B显示,阿莫西林与Cr6+共存时,抑菌圈直径变化率分别为51.05%(0.1 mg/L)、64.72%(2 mg/L)、35.79%(10 mg/L)、96.46%(50 mg/L),表明随Cr6+浓度的升高,协同杀菌作用逐渐增强;头孢拉定与Cr6+共存时,抑菌圈直径由10.5增大到15.13 mm,抑菌圈直径变化率范围为-15.95%～21.02%,结果表明低浓度Cr6+与头孢拉定表现协同抗性作用,较高浓度Cr6+与头孢拉定表现协同杀菌作用;四环素与Cr6+共存时,抑菌圈的直径变化率范围为-5.45%～4.18%,表明Cr6+存在时抑菌圈直径变化率很小,但抑菌作用随Cr6+浓度的升高而增强.庆大霉素与Cr6+共存时,抑菌圈直径变化率为0.53%(0.1 mg/L)、-1.97%(2 mg/L)、-9.68%(10 mg/L)、-10.88%(50 mg/L),表明Cr6+存在,主要表现协同抗性作用.

B

3) Cu2+浓度对C32的抗生素的抗性影响.图3C显示,当Cu2+与阿莫西林共存时,抑菌圈直径变化率范围为-10.10%～15.08%(0.1～1 200 mg/L),说明低浓度Cu2+共存对C32的阿莫西林抗性影响很小;但当Cu2+质量浓度为1 400和1 600 mg/L时,抑菌圈变化率分别为74.10%和87.01%,说明高浓度Cu2+与阿莫西林表现为协同杀菌,且随Cu2+浓度升高而增大;Cu2+与头孢拉定共存时,抑菌圈直径变化率范围为-37.92%～-3.73%(0.1～500 mg/L),27.73%～42.08%(1 000～1 600 mg/L),结果表明低浓度Cu2+与头孢拉定表现协同抗性作用,较高浓度Cu2+与头孢拉定表现协同杀菌作用;Cu2+与四环素共存时,抑菌圈的直径变化率范围为-14.12%～31.21%(0.1～1 600 mg/L),表明Cu2+存在时,表现低浓度为协同抗性作用,高浓度为协同杀菌作用;庆大霉素与Cu2+共存时,抑菌圈的直径变化率范围为-4.36%～46.40%(0.1～1 600 mg/L),结果表明低浓度Cu2+与庆大霉素表现协同抗性作用,较高浓度Cu2+与庆大霉素表现协同杀菌作用.

C

2.4.4C32抗生素抗性与重金属种类之间的关系 由表4可知,菌株的抗生素抗性变化可能只与重金属种类相关,Cd2+的共存导致菌株的四环素、阿莫西林和头孢拉定抗性减弱;Cr6+存在时,使菌株阿莫西林抗性明显减弱;而Cu2+的共存导致菌株的四环素抗性明显减弱.敏感程度变化见表4.

表4 重金属共存对抗生素敏感性的影响

3 讨论

抗生素是一种天然或人工条件下产生的可以抑制其他细菌生长的物质.畜禽养殖过程中饲喂抗生素会导致抗性基因的出现,且饲喂抗生素的种类和浓度与细菌的抗生素抗性基因有明显的正相关性[7,13],抗生素的长期滥用易引起环境细菌抗生素抗性基因扩散,这已成21世纪威胁人类健康的最大挑战之一[14],微量金属元素随畜禽饲料添加剂进入环境,金属元素的含量也影响着抗生素抗性基因的丰度,使环境细菌同时具备重金属抗性与抗生素抗性,加剧了细菌耐药水平[15-17].为研究重金属和抗生素复合污染对畜禽养殖生态环境的影响,本研究通过实验室条件从成都市某废弃畜禽养殖场土壤中筛选出抗生素抗性菌株C32,并对其进行了耐药性质的鉴定及重金属胁迫对其抗生素抗性影响的测定.结果发现:C32耐药性质的鉴定表明其具有四环素、头孢拉定和阿莫西林抗性,经16S rDNA鉴定C32属于Citrobacterfreundii,属条件致病菌,在适宜的条件下可引起人体脑膜炎、创面感染和败血症等疾病,亦可引发食物中毒,造成食源性污染,故对畜禽养殖而言有较高风险.重金属和抗生素间的交互作用表现为抗生素抗性随重金属浓度增加而减弱的协同抗性作用和抗生素抗性随重金属浓度增加而增强的协同杀菌作用.方差分析表明,不同的重金属种类和浓度对C32的抑菌圈直径有显著影响(P<0.05),说明C32的抗生素抗性水平与重金属的种类和浓度有着密切的关系.重金属和抗生素之间的吸附和络合作用可能影响其协同作用,Wang等[18]研究表明四环素与Cu2+之间能形成络合物,并在土壤中显著影响环境化学行为,改变Cu2+的生物有效性,如Cu2+可以增强阿莫西林的杀菌效果,以及四环素可以增加Cu2+在畜禽养殖土壤上的吸附量[18-19].杨统一等[20]报道的Cu2+与头孢拉定的交叉组合对细菌的抗性作用表现为:低浓度时表现协同抗性作用,高浓度时表现协同杀菌作用,本研究中Cu2+与头孢拉定、Cu2+与阿莫西林、Cu2+与四环素及Cu2+与庆大霉素分别交叉组合时的抗性作用结果与其他的结果表现较为一致,可能是因为在畜禽养殖过程中,低浓度的重金属作为营养素能刺激细菌的生长,而在高浓度时与菌株的酶或DNA结合,抑制细菌生长[21],但这与抗生素的抑菌作用机制不同,导致不同重金属对其影响也不同,如阿莫西林和头孢拉定主要抑制细胞壁的合成[13].孙建平[22]研究表明重金属与抗生素的毒性可以发生叠加,使得菌株的抗生素的敏感性降低,从而表现为协同杀菌作用.当Cr6+与头孢拉定交叉组合时,低浓度时表现协同抗性作用,高浓度时表现协同杀菌作用;当Cr6+与阿莫西林交叉时,表现为协同杀菌作用;当Cr6+与庆大霉素或四环素分别交叉组合时,重金属离子从低浓度开始即表现为协同抗性;可能是Cr6+既有毒性,又有致突变性,Cr6+会引起细菌DNA损伤[23],Cr6+的毒性与头孢拉定或阿莫西林的杀菌效果有相加作用,表现为协同杀菌作用,而大部分的微生物都能依赖其自身特殊的结构,发生氧化还原反应,可使Cr6+转化成Cr3+的形态,从而达到降低毒性的效果,这就可能使得高浓度的Cr6+与四环素或庆大霉素组合表现为协同抗性.Cd2+与庆大霉素或阿莫西林组合时具有协同杀菌作用;Cd2+与头孢拉定或四环素分别交叉组合，表现为低浓度和协同抗性作用,高浓度表现为协同杀菌作用;可能是抗生素能使Cd2+在畜禽养殖土壤上富集[19],使杀菌效果增强而表现协同杀菌.可是,也有一些研究结果表明，重金属离子可以降低细菌的抗生素敏感性[24],从本研究结果来看,Cd2+的共存导致菌株的四环素、阿莫西林和头孢拉定抗性减弱;Cr6+存在时,菌株阿莫西林抗性明显减弱;Cu2+的共存导致菌株的四环素抗性明显减弱,而此时重金属浓度对抗生素抗性表现无显著影响,表明C32的某些耐药性与重金属浓度无关.由此,高浓度的重金属离子虽然能降低抗生素的敏感性,达到降低耐药性的目的,但重金属会在环境中富集,并且难以降解,污染畜禽养殖的生态环境.畜禽饲料添加剂的重金属应避免加入大剂量的Cu2+,Cr6+与阿莫西林和Cd2+与庆大霉素或阿莫西林在低浓度状态下即能达到杀菌和降低抗生素敏感性的效果,可联合使用以降低细菌的耐药性,具有一定的应用价值.本研究虽然对部分金属离子对抗生素抗性的影响有探究,但针对重金属与不同抗生素复合效用的基因定位等仍需进一步研究.因此,探究细菌的多重抗性、重金属和抗生素的交互效应对修复重金属与抗生素的复合污染、探明治理过程中的微观机制起着重要作用[25].

4 结论

从成都市某废弃畜禽养殖场土壤中筛选出一株具有抗生素抗性菌株C32,经鉴定属于柠檬酸杆菌属(Citrobacter),具有阿莫西林、头孢拉定和四环素多重抗性,对重金属Cd2+、Cr6+、Cu2+的MIC分别为125、125和1 600 mg/L.研究表明重金属的浓度及种类均会对C32的抗生素抗性影响显著(P<0.05),在Cu2+、Cd2+与头孢拉定、Cd2+与四环素及Cu2+、Cr6+与庆大霉素交叉组合时,重金属低浓度时表现协同抗性作用,高浓度时表现协同杀菌作用.Cr6+、Cd2+与阿莫西林及Cd2+与庆大霉素交叉组合，表现为协同杀菌，且随着重金属浓度升高,抑菌能力逐渐增强.