雅连、味连和云连愈伤组织诱导及培养条件的优化

李 姣, 林诗语, 孙 成, 魏旭东, 牟翠黎, 施娇娇, 张 红

(四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101)

据中国药典[1]记载,黄连是指毛茛科黄连属植物雅连(Coptisdeltoidea)、味连(Coptischinensis)和云连(Coptisteeta)的干燥根茎,是我国著名中药材,具有显著的抗癌[2-3]、降血脂[4-5]等功效.然而,黄连人工栽培难度大,生长期长,产量低[6],加上过度采集野生黄连,造成黄连种质资源相对匮乏,已列入国家二级保护植物.因此,建立高效且遗传稳定性好的黄连再生体系,不仅能提高产量,满足市场需求,还能保存种质资源.

黄连极难再生[7],黄连组织培养研究大都集中在愈伤组织培养[8-12],国内仅侯嵩生与桂耀林报道了黄连经胚性愈伤组织诱导出的体细胞胚胎发生途径产生再生植株[13-14].胚性愈伤组织不仅是体细胞胚胎直接发育为完整植株的前提,也是黄连定向遗传转化的理想受体[7].因此筛选出最适于黄连愈伤组织(特别是胚性愈伤组织)诱导的培养条件是建立黄连再生体系的关键.

本文对雅连、味连和云连3种黄连的愈伤组织诱导的3个影响因素[9,15](外植体、植物生长激素和培养条件)进行优化，以期为黄连愈伤组织的进一步研究和利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1供试植物材料 三年生味连、雅连和云连植株分别采自四川省峨眉山市黑水村(29°36′0″N,103°21′59″E,925 m 海拔高度)、四川省眉山市洪雅县黑山村(29°29′50″N,103°9′56″E,1 879 m 海拔高度)和云南省怒江傈僳自治州泸水市鲁掌镇(26°2′49″N,98°45′35″E,2 634 m 海拔高度).

1.1.2实验试剂 已有研究表明适于黄连愈伤组织诱导的基础培养基是6,7-V培养基[12]，该培养基所需的化学药品如表1所示.

1.1.3实验仪器 pH检测仪、培养瓶、高压蒸汽灭菌锅、剪刀、镊子、剪剖刀、酒精灯、超净工作台.

1.2 实验方法

1.2.1黄连愈伤组织诱导培养基的配制 本实验在6,7-V培养基中加质量浓度30 g/L的蔗糖、质量浓度7.5 g/L的琼脂和不同配比的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)等植物生长激素组合，用pH调整液调pH值为5.8.其中，4种植物生长激素的配制(质量浓度mg/L)组合分别为：

表1 配制黄连基础培养基6,7-V的化学药品及质量浓度

2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA/IAA(0.5)，
2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA/IAA(1.0)，

2,4-D(0.5)+6-BA(2.5)+NAA(0.5)，
2,4-D(0.5)+6-BA(2.5)+NAA(1.0).

pH调节液为0.1 M HCl和1 M NaOH，灭菌剂分别为体积分数75%的乙醇、体积分数0.1%的氯化汞.

1.2.2黄连外植体的灭菌 分别从健康的味连、雅连和云连植株中选取幼嫩的茎和带叶柄的叶,先用自来水流水反复冲洗10 min,洗去表面的泥土和灰尘等污垢,用滤纸吸干表面水分后放入洁净的烧杯中.从乙醇和氯化汞的不同灭菌时间组合条件中筛选出黄连外植体最适宜的灭菌方式.将灭菌后的外植体用无菌蒸馏水冲洗5次,每次5 min,然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分.

1.2.3黄连外植体的接种 用剪刀将茎剪为长度约1.0 cm的小段,用剪剖刀将叶片切为0.5 cm×1.0 cm左右的带叶柄或不带叶柄的小块.为了增加外植体的创伤面积,提高愈伤组织诱导率,用刀片在茎段上划一些痕(深度约为1～2 mm,划痕间距约为3～4 mm),用剪刀沿叶块边缘轻轻剪出一些小口 (小口间距约为3～4 mm).然后将外植体接种至愈伤组织诱导培养基中,每个培养瓶中接种2～3个外植体,每种黄连各50瓶.

1.2.4培养条件 培养温度为(25±2)℃,湿度为60%～70%.随机将接种至愈伤组织诱导培养基中的黄连培养瓶数量的1/2(25瓶)置于日光灯照射下,光照强度为1 500 Lx,光照周期为16 h/d;另25瓶置于黑暗条件下,用报纸将培养瓶包裹严密,避免光照.

1.2.5数据统计 每隔4 d观察一次外植体的生长状态,及时记下出现污染、褐化以及愈伤组织的外植体数量.使用Microsoft Excel 2013软件统计数据,分别用以下公式计算黄连外植体的污染率、褐化率和愈伤组织诱导率：

2 结果与分析

2.1 黄连外植体灭菌方式对污染率的影响如表2所示,将外植体先用乙醇浸摇30 s，再用氯化汞浸摇10 min的灭菌方式有效清除了雅连和云连外植体的杂菌,两者污染率分别为16%和19%;然而不能清除味连外植体的杂菌,其污染率高达100%.

表2 黄连外植体的灭菌方式

因此,在此灭菌方式基础上增加一次体积分数0.1%氯化汞浸摇10 min后,味连外植体污染率降至10%.

2.2 黄连外植体类型、植物生长激素和光照条件对黄连愈伤组织形成的影响

2.2.1黄连外植体类型对愈伤组织形成的影响 将黄连外植体接种到含有不同植物生长激素组合(具体组合见2.2.2)的6,7-V培养基(pH 5.8)上,在光照或黑暗条件下诱导愈伤组织.接种45 d后光照条件下黄连外植体未出现愈伤组织;黑暗条件下除了黄连茎段未出现愈伤组织以外,叶柄(图1A)、无叶柄叶片(图1B)和带叶柄叶片(图1C)出现了较多数量的愈伤组织,愈伤组织诱导率分别为70.8%、83.3%和87.5%(表3).

A B C

带叶柄叶片产生的愈伤组织不仅数量最多,生长状况也最好,质地紧密,颜色呈黄白色,具有胚性愈伤组织的典型特征.这些结果表明带叶柄叶片是诱导黄连胚性愈伤组织形成的最适宜的外植体,还表明不同种类和浓度的植物生长激素对不同品种黄连愈伤组织诱导的影响不同.

表3 黄连不同外植体类型产生的愈伤组织的生长情况

2.2.2 植物生长激素对黄连愈伤组织形成的影响如表4所示,以带叶柄叶片为外植体,雅连愈伤组织诱导率在激素组合为2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)时最高,为58%;在激素组合为2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA(0.5)时降为39%.味连和云连愈伤组织诱导率在激素组合为2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA(0.5)时都是最高的,分别是40%和43%.与IAA相比,NAA诱导味连和云连外植体产生的愈伤组织数量更多,颜色略深,质地更紧密,体积明显更大,因此更利于愈伤组织形成.这些结果表明雅连愈伤组织诱导只需要2,4-D和6-BA两种激素,而味连和云连愈伤组织诱导需要2,4-D、6-BA和NAA等3种激素.

表4 不同植物生长激素组合对黄连愈伤组织形成的影响

2.2.3光照条件对黄连愈伤组织形成的影响 如表5所示,光照条件(光照强度1 500 Lx,光照周期16 h/d)下3种黄连的外植体不仅未产生愈伤组织,而且有严重的褐化现象,褐化率高达93%.然而,黑暗条件下黄连外植体愈伤组织诱导率为74%,褐化率为7%,表明黑暗条件最适于黄连愈伤组织诱导.这些结果说明了植物细胞内催化酚类物质的氧化酶需要光诱导,而黑暗培养能降低氧化酶活性,抑制酚类物质的氧化,降低外植体褐化率.

表5 光照条件对黄连愈伤组织形成的影响

3 讨论

前人在黄连组织培养中采用茎尖、茎段、花梗、嫩叶等作为外植体,虽然都成功诱导出愈伤组织[7-14,16-17〗,但都是研究一种黄连的愈伤组织诱导,没有系统地研究最适于雅连、味连和云连3种黄连愈伤组织诱导的外植体类型.由于黄连茎尖和花梗材料来源少,具有局限性,本研究分别采用雅连、味连和云连的茎段与嫩叶进行愈伤组织诱导,发现以带叶柄叶片为外植体愈伤组织诱导率高,并且诱导形成的愈伤组织质地致密,呈黄白色,具有胚性愈伤组织的显著特征.这个以带叶柄叶片为适宜的3种黄连外植体诱导出大量胚性愈伤组织的发现,对后续研究中提高黄连遗传转化率和植株再生率具有重要意义,也扩大了黄连胚性愈伤组织诱导的外植体范围.

植物生长激素的种类与浓度配比不仅影响愈伤组织诱导,还影响愈伤组织转化为胚性愈伤组织.KT、2,4-D、6-BA、NAA和IAA等植物生长激素成功地诱导出黄连愈伤组织[7-14],然而都只是从一种黄连中诱导出愈伤组织,而且只有少数研究将诱导出的愈伤组织转化为了胚性愈伤组织[13-14].本研究对雅连、味连和云连3种黄连愈伤组织诱导的激素种类和浓度进行系统研究后,发现雅连愈伤组织的诱导需要2,4-D 和6-BA两种植物生长激素,两者质量浓度分别为0.5、2.0 mg/L时最适于雅连愈伤组织诱导;味连和云连愈伤组织的诱导需要2,4-D、6-BA和NAA等3种植物生长激素,三者质量浓度分别为0.5、2.0、0.5 mg/L时最适于味连和云连愈伤组织诱导.

有研究在光照强度1 200 Lx和光照周期16 h/d的条件下成功诱导出味连愈伤组织[12],也有研究发现黑暗更有利于雅连愈伤组织诱导[17].本研究发现黑暗培养下雅连、味连和云连3种黄连愈伤组织诱导率高,褐化率低,因此黑暗条件最适于黄连愈伤组织诱导.

植物组织培养褐化的影响因素[18]有多种,包括外植体(生理状态与年龄、取材时间、灭菌方式等)、培养基(琼脂与植物生长激素的浓度、pH等)、培养条件(光照或黑暗)等.本研究在3月选取健康的三年生黄连植株上的幼嫩的带叶柄叶片为外植体,采用适宜的灭菌方式和培养基,在黑暗条件下诱导黄连愈伤组织,大大降低了3种黄连外植体的褐化率.

本研究不仅诱导出3种黄连的愈伤组织,还在外植体、植物生长激素和培养条件3个关键因素方面优化了愈伤组织诱导的条件,获得了大量胚性愈伤组织,为后续研究诱导胚性愈伤组织产生体细胞胚胎、建立高效且遗传稳定性好的黄连再生体系奠定基础；对提高黄连产量,满足市场需求,有效保护黄连种质资源具有重要意义.同时，胚性愈伤组织是植物定向遗传转化的理想受体，本研究中大量胚性愈伤组织的获得，还为后续研究采用基因枪法转化黄连生物碱合成途径中的关键酶基因奠定了基础.

致谢四川师范大学2019年度“大学生创新创业训练计划”项目对本文给予了资助,谨致谢意.