孤独症谱系障碍儿童家庭共有肠道细菌组成及其诊断价值

徐玉兵，刘兴晖，张蜀豫，肖 玲，程雅婷，孟晓伟，陈 禹*

(1 上海金域医学检验所有限公司实验诊断部，上海 201301；2 上海市浦东新区公利医院检验科；3 海军军医大学附属东方肝胆外科医院肝外四科；4 广州金域医学检验中心有限公司实验诊断部；* 通讯作者,E-mail:sh-chenyu@kingmed.com.cn)

《精神疾病诊断及统计手册第五版》将孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)定义为以社交损伤、行为方式刻板和兴趣狭窄为核心症状的一组精神发育障碍[1]。ASD儿童成年后缺乏独立生活能力，需要被照顾终生，成为巨大的家庭精神负担和社会经济负担[2,3]。基于全球的数据显示ASD的发病率在3～17岁儿童中逐年升高[4]。虽然目前还不明确ASD的确切病因，但是大量研究发现ASD的发生和发展可能由遗传因素和环境因素共同影响[5]。而肠道菌群组成作为重要的环境因素之一可能与ASD的发生发展具有因果关系[6,7]。

来自产道、乳腺、皮肤、肠道等部位的母源共生细菌可以通过相应的途径传递给新生儿，这种现象称做母源细菌的垂直传递。肠道菌群可以通过循环系统迁移到产道、乳腺等部分，影响产道菌群、母乳菌群的组成。母源肠道菌群以及其他部位菌群对子代构建肠道菌群具有重要意义。相应的，母源肠道菌群垂直传递失调引起子代肠道菌群的紊乱，与子代的精神类疾病的发生发展有关[8,9]。通过皮肤接触等途径，父亲的肠道菌群结构也对子代的肠道菌群组成具有影响[10]。不仅如此，有研究显示即使年龄、地域、种族具有差异，人类肠道菌群也存在共有的组成部分，被称为“核心细菌”。这些“核心细菌”可能承担着重要的生理功能[9,11]。因此，有必要明确家庭共有的肠道细菌组成与ASD的关系，及其对临床的意义。

本研究对已公开的来自一项临床研究(ChiCTR-RPC-16008139)的ASD儿童及其父母和正常发育儿童及其父母的肠道菌群数据[9]进行再分析，发现ASD儿童相对于正常发育儿童家庭共有的肠道细菌组成具有差异，并且利用这些差异建立具有诊断意义的肠道细菌紊乱指数(gut bacteria dysbiosis index, GBDI)指数[12]。

1 材料和方法

1.1 病例

本研究回顾性分析了Chen等[9]研究中的ASD儿童及其父母和正常发育儿童及其父母的粪便中的肠道菌群(细菌16S rRNA基因V3-V4区)数据，其中ASD儿童为71例(其父母均为71例)，正常发育儿童为39例(其父母均为39例)，合计330例样本。人群基础信息和分组信息见于Chen等[9]的研究，此研究(ChiCTR-RPC-16008139)在中国临床试验注册中心注册。

1.2 生成扩增序列变异

肠道菌群测序数据来自NCBI的序列读取存档(short read archive, SRA)数据库，检索号为PRJNA644763和PRJNA715668。利用2022.02版微生物生态学的定量研究(quantitative insights into microbial ecology, QIIME2)软件进行生物信息学处理，流程如下：①在QIIME2中导入测序原始文件；②依据文献中的描述切除PCR引物的序列信息[9]；③对序列进行质量控制；④利用QIIME2中的DADA2指令降噪；⑤基于重叠的长度不小于20的原则拼接序列，获得各个样本的扩增序列变异(amplicon sequence variants, ASVs)丰度文件和代表序列文件；⑥将所有的样本的序列数均一化到10 000，获得各个样本细菌的相对丰度；⑦在席尔瓦(SILVA)参考数据库(136版)中注释ASVs的分类地位(80%相似度)。

1.3 关键家庭共有ASVs的挑选

利用R语言(3.3.3版)中的“mixOmics数据包”实现偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)，并且进行后续“leave-one-out”交叉验证，挑选对PLS-DA分类模型器贡献最高的家庭共有ASVs作为关键家庭共有ASVs。

1.4 GBDI的计算

引用Wang等[12]的研究计算GBDI：

其中∑ASVsa代表在ASD儿童中升高并且有统计学意义的关键家庭共有ASVs相对丰度之和，∑ASVst代表在正常发育中升高并且有统计学意义的关键家庭共有ASVs相对丰度之和，A代表在ASD儿童中升高并且有统计学意义的关键家庭共有ASVs的个数，T代表正常发育儿童中升高并且有统计学意义的关键家庭共有ASVs的数目。

1.5 统计学分析

本研究所有的统计学分析均使用SPSS软件(IBM公司，26.0版)完成。利用Mann-WhitneyU检验分析ASD儿童和正常发育儿童之间ASVs相对丰度的差异是否具有统计学意义。P<0.05表示差异具有统计学意义。利用“leave-one-out”交叉验证检验GBDI的受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)模型，P<0.05表示差异具有统计学意义，并且利用尤登系数计算GBDI阈值，以及该阈值下对应的诊断ASD的敏感度和特异性。

2 结果

2.1 获得家庭共有肠道细菌

对临床试验ChiCTR-RPC-16008139中的ASD儿童(71例)及其父母和正常发育儿童(39例)及其父母共330例粪便肠道菌群测序数据(细菌16S rRNA基因V3-V4区)进行分析，得到7 552 303条高质量序列，样本平均(22 885.8 ±4 677.9)条。序列剪切、拼接和降噪后，得到4 325个ASVs。

本研究中某个ASV同时在儿童和其父母粪便中检测到，则认为此ASV被这个家庭共有。一个ASV被任意一个家庭共有，定义此ASV 为家庭共有ASV(shared-ASV)。本研究中，330 个样本共获得264个家庭共有ASVs。

2.2 挑选关键家庭共有肠道细菌

基于家庭共有ASVs的相对丰度矩阵建立PLS-DA模型，发现ASD儿童和正常发育儿童在空间上分为2个簇(见图1)，提示家庭共有ASVs的结构明显不同。而后挑选对模型判别能力贡献较大的成员，经过“leave-one-out”交叉验证，当PLS-DA模型选择前4个成分(分别为成分1，2，3，4)时，模型的整体错误率最低(数值为0.261)。当各个成分错误率最低时，4个成分分别挑选了贡献度排名前3、前2、第1和前4个的家庭共有ASVs，定义这些ASVs为关键家庭共有ASVs(见表1)。

表1 关键家庭共有肠道细菌

对ASD儿童和正常发育儿童中关键家庭共有ASVs进行分析，发现家庭共有ASV2090(Bacteroides)和家庭共有ASV2223(LachnospiraceaeND3007group)的相对丰度在ASD儿童中升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而家庭共有ASV493(Erysipelatoclostridium)，家庭共有ASV3419(Lachnospiraceae)和家庭共有ASV3051(Blautia)的相对丰度在ASD儿童中降低，差异具有统计学意义(P<0.05，见表2)。

蓝色圆圈代表ASD儿童(71例)，而红色三角形代表正常发育儿童(39例)

表2 ASD和正常发育儿童之间关键家庭共有ASVs差异

2.3 利用家庭共有ASVs计算具有诊断ASD能力的生物标志物

基于ASD儿童相对于正常发育儿童具有显著差异的关键家庭共有ASVs，依据Wang等[12]研究中GBDI的计算方法分别计算ASD儿童和正常发育儿童的GBDI，分别为-0.060 ±0.034和-0.381 ±0.072。

建立ROC模型检验GBDI诊断ASD的效力，经过“leave-one-out”交叉验证，发现ROC模型的曲线下面积为0.810(95%CI为0.721～0.900，P<0.01)，表明模型具有诊断ASD的潜能。基于尤登指数，计算最佳阈值，发现GBDI为-0.182时，敏感度为74.6%，特异性为79.5%(见图2)。

图中的点表示GBDI的阈值

3 讨论

人类不仅有“血脉”，还有“菌脉”，或者称之为人类共生微生物的垂直传递，其途径主要包括胎盘、产道、母乳、皮肤接触、共同生活环境等[10]。这种垂直传递对子代肠道菌群的早期建立至关重要，持续影响着子代肠道菌群的功能，而肠道菌群的功能对子代神经系统的发育和功能具有调控作用[13]。肠道菌群的垂直传递分为母源和父源。大量研究显示，母源肠道菌群垂直传递通过影响子代的肠道菌群结构间接调控子代能量代谢、神经系统发育等多项生理过程。母源垂直传递与诸如精神发育障碍在内的多种人类常见疾病密切有关。Chen等[9]发现虽然ASD儿童母亲的肠道菌群结构、多样性和丰富度相较正常发育儿童母亲无明显变化，然而儿童和母亲共有肠道细菌变化与ASD特定的临床症状密切相关，这表明ASD儿童母源肠道菌群垂直传递可能发生了改变。父源菌群垂直传递一般被认为是父亲通过皮肤接触、共同的生活环境、基因对肠道细菌定植的偏好性将自身肠道菌群传递给子代的过程，同样对子代健康具有重要意义[14]。不仅如此，儿童和父母具有一些共有的肠道细菌，这些家庭共有肠道细菌相对于其他细菌可能在基础的生命活动中扮演着更重要的角色，如神经系统的发育和功能。这些细菌也被认为是肠道菌群中的“核心”部分[11]。

本研究发现属于Bacteroides的家庭共有肠道细菌在ASD儿童中升高，属于Lachnospiraceae和Blautia的家庭共有肠道细菌在ASD儿童中降低。这些肠道细菌在儿童中的特征性变化可能与ASD的发生发展密切相关。Liu等[15]的研究荟萃分析了2018年3月后收录于Medline，EMBASE，Web of Science和Scopus数据库上的16篇研究性论文的数据，发现ASD儿童相对于正常发育儿童，Bacteroides升高，而Blautia显著降低。Bacteroides中的很多成员具有引起机体慢性炎症的功能，而长期的慢性炎症会影响儿童的神经发育，是诱发精神发育障碍的危险因素[16]。属于Blautia和Lachnospiraceae的很多肠道细菌成员可以产生短链脂肪酸，如丁酸。Yan等[17]发现丁酸有效缓解小鼠胚胎、成纤维细胞和人胚肾293细胞中赖氨酸23中组蛋白H3的酰化缺陷，而这种缺陷是发育迟缓儿童的重要特征之一。因此，丁酸产生菌可能缓解儿童的发育迟缓。这些研究表明本研究发现的特征性变化的家庭共有肠道细菌可能与ASD的发生发展具有因果关系。

诊断ASD的金标准为心理学评估，而评估需要至少2名具有资质的专业医生连续开展至少4 h，不利于在大规模人群中开展ASD的筛查。本研究检测人群的粪便样本，样本便于采集、保存和运输，并且为非侵入性检测项目，无安全隐患，具有开展大规模人群筛查的优势。但本研究也存在一定的不足，首先，本研究并非多中心研究，生活习惯、饮食习惯等环境因素可能系统性干扰研究结果；其次，样本量较小；再次，本研究为回顾性研究。所以，未来可以开展多中心、更大人群的前瞻性研究，检验此生物标志物预测儿童罹患ASD风险的能力，为ASD的早期诊断提供临床指导。 综上所述，本研究揭示了ASD儿童与父母共有的肠道细菌组成特征，基于此特征发掘了具有诊断ASD潜能的生物标志物，这为未来肠道菌群运用于ASD临床诊疗提供了新的方向。