FTO介导RNA的m6A修饰与发育的研究进展

潘明敏，王启阳，杨丽萍

(河南中医药大学 中西医结合基础学科， 河南 郑州 450046)

随着RNA甲基化免疫共沉淀高通量测序(m6A-specific methylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing, MeRIP-seq)技术的出现，大量可逆的化学修饰开始被深入鉴定和研究，尤其是6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修饰。m6A修饰作为mRNA上最为常见的甲基化修饰形式，可以调控真核生物mRNA的剪接、出核、稳定和翻译，同时参与了干细胞分化，精子发生、脑发育等多种生物学功能。m6A修饰受甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白的协同调控。甲基化酶包括METTL3(methyltransferase like 3)、METTL14(methyltransferase like 14)、WTAP(Wilms’ tumor 1-associating protein)，去甲基化酶包括FTO(fat mass and obetity associated protein)和ALKBH5(alkB homolog 5)，结合蛋白主要是YTH结构域蛋白，包括YTHDF1(YTH domain family member 1)、YTHDF2(YTH domain family member 2)、YTHDF3(YTH domain family member 3)、YTHDC1(YTH domain containing 1)和YTHDC2(YTH domain containing 2)，当参与m6A修饰的酶或结合蛋白表达异常，可导致发育受阻并产生多种疾病。

本文对首次鉴定提出的m6A去甲基化酶FTO及其介导的生长发育进行阐述，以期能深入了解FTO在生长发育和疾病发生发展过程中的变化规律。

1 FTO

1999年在对插入突变产生的具有融合脚趾(fused toes，FT)表型小鼠研究中发现，Fto基因是突变所致缺失的一个最长基因，涵盖超过400 kb的基因组序列，其不仅在成年小鼠组织中广泛表达，在胚胎发育过程中也起着重要作用[1-2]。2007年全基因组关联分析提示它与人体体质指数(BMI)增加和肥胖密切相关，并将其命名为脂肪含量和肥胖相关基因(fat mass and obesity associated protein)[3]。对其结构进行进一步研究发现FTO具有Fe2+和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶特征，属于ALKB蛋白家族中的一员，大多定位于细胞核[4]。2010年体外研究首次证明FTO是一种类似于ALKB的DNA/RNA脱甲基酶，对单链DNA中的3-甲基胸腺嘧啶和单链RNA中的3-甲基尿嘧啶有强烈的偏好性，同时暗示其对RNA可能有去甲基化作用[5]。深入探究表明FTO在单链和双链RNA中均以m6A为靶点发挥去甲基化作用，因此正式将FTO蛋白功能定义为m6A去甲基化酶[6]。至此，开启了FTO与甲基化研究的序幕。

在已鉴定到的150多种RNA化学修饰中，m6A是mRNA上丰度最高、最常见的甲基化修饰形式[7]。m6A修饰分布存在一定的规律性，主要分布在mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region，3′UTR)、转录起始区(transcription start site，TSS)和序列编码区(coding sequence，CDS)。尤其在3′UTR的前部及CDS的终止密码子区产生大量富集[8]。修饰的区域决定了m6A的不同调控功能，如调控脑发育和记忆的形成、造血干细胞的定向分化、精源细胞生成、胚胎发育、肿瘤生成等。m6A修饰作用的发挥需要甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白的协同参与。m6A甲基转移酶包括METTL3、METTL14和WTAP复合物等，主要作用是催化mRNA的腺苷酸发生m6A修饰；去甲基化酶是FTO和ALKBH5，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化；结合蛋白主要是具有YTHDF结构域的蛋白，用来识别发生m6A修饰的碱基，激活下游的调控通路，调控mRNA的剪接、出核、定位、稳定和翻译[9]。而在整个动态修饰过程中FTO的作用尤为突出，FTO具有较高的催化活性，其沉默和过表达与mRNA上m6A的增加和减少直接相关[10]。同时研究表明FTO参与了各种发育过程，与体脂发育、胚胎发育、脑发育、神经发育等紧密相关。

2 FTO及其介导的m6A/mRNA修饰与发育的关系

2.1 调节脂肪生成和体脂代谢

FTO在调节脂肪生成和能量稳态平衡中起着重要作用。Fto过表达的小鼠会出现身体和脂肪质量的依赖性增加从而导致肥胖，而Fto缺乏的小鼠会在出生后出现生长迟缓和食物摄取量减少，并伴随脂肪组织减少，死亡率增加[11]。自噬是控制脂肪细胞分化、促进脂肪生成的重要途径，FTO可通过其介导的m6A修饰影响自噬过程，控制脂肪生成。敲除Fto可导致自噬相关因子ATG5和ATG7 mRNA的m6A修饰水平升高，mRNA降解和蛋白表达下降，脂肪生成减少[12]。前脂肪细胞3T3-L1中敲低Fto可抑制前脂肪细胞分化，使脂肪组织生成减少，反之过表达Fto则促进其分化过程，使脂肪组织生成增加。究其原因发现，过表达Fto能够使脂肪细胞内m6A水平降低，脂肪诱导分化水平提高，脂肪组织生成增加[13]。同时脂肪细胞数量的增加，与脂肪组织Fto的mRNA水平和细胞分化阶段Fto的mRNA表达呈正相关,与脂肪细胞编码基因mRNA的m6A水平成负相关。过表达去甲基化酶FTO可以显著降低脂肪细胞mRNA的m6A水平，使与脂肪分解相关的三酰甘油脂肪酶(adipose triacylglyceride lipase，ATGL)和激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)基因的表达水平下降，进而影响细胞内脂肪的沉积。其作用机制为FTO可通过调节剪接位点附近的m6A水平进而控制外源性脂肪生成相关转录因子1(RUNX1T1)的剪接，从而在剪接位点周围积累富含丝氨酸/精氨酸SR蛋白(SRSF2)，产生长型和短型两种亚型的RUNX1T1蛋白质，而FTO则主要通过增加RUNX1T1的短型，促进脂肪细胞分化，调控脂肪生成[14]。综上所述，脂肪细胞中的FTO通过动态调控m6A修饰参与脂肪生成调控基因子集的剪接和基因表达，进而影响脂肪组织生成。

2.2 调节胎盘和胚胎发育

FTO在胎盘中高表达，其参与胎盘和胚胎发育的机制包括两个方面：直接FTO效应(与胎盘生长调节无关而直接与胎儿大小有关)和间接FTO效应(通过影响胎盘重量和胎盘功能)。早期学者大多认同直接效应，认为Fto可直接参与并控制胎儿体质量增加[15]，胎盘中Fto的表达水平增高，新生儿的头围大小和增长速度增加，胎儿身长也会增加[16]。而近年来学者研究提出，胎盘Fto基因的mRNA表达水平与产妇的胎盘质量密切相关，胎盘中FtomRNA的表达水平可通过影响胎盘特定氨基酸转运蛋白的表达进而影响胎盘质量，调控胎儿发育。在动物实验中发现：仔猪低出生体质量(low birth weight,LBW)的胎盘中FTO蛋白表达水平降低，m6A修饰水平升高，胎盘中血管生成和脂质代谢基因的表达降低，特别是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的蛋白水平下降，胎盘血管和营养体转运功能受阻，从而产生LBW胎盘[17]。研究也发现，在应激状态下，孕鼠胎盘中m6A水平升高，FTO表达水平下降，胎盘血管生成因子功能受损，胎盘重量降低，活胎数减少。可见，胎盘中FTO通过影响胎盘血管发育及营养物转运体功能而调节胎盘及胚胎发育。

2.3 调节大脑的发育和功能

FTO广泛分布于大脑不同区域，如下丘脑、海马区、前额叶皮质区以及小脑区域等，Fto的表达水平与大脑发育和功能密切相关[18]。Fto缺乏会导致大脑体积的缩小，同时也会降低体内成年神经干细胞的增殖和分化，进而导致学习记忆障碍[19]。与野生型小鼠相比，Fto缺失型小鼠在学习能力和短时记忆能力表现较差[20]。恐惧记忆作为一种独特的负性记忆与FTO的关系尤为紧密。成年神经元中FTO缺失会导致m6A水平上升，突触可塑性改变，增强恐惧记忆[21]。不同脑区中FTO缺失均可导致恐惧记忆的持续存在，在野生型小鼠背侧海马区利用CRISPR/Cas9技术特定敲除FTO，可使mRNA的m6A水平升高，恐惧记忆增强[22]；靶向注射shRNA敲除小鼠脑内前额叶皮质中的FTO，m6A总水平升高，小鼠在训练后24 h测得的恐惧记忆也会明显增强[22]。机制研究表明，FTO主要通过影响抗记忆基因mRNA不同位点的去甲基化从而抑制记忆前转录本的翻译，进而增强恐惧记忆。可见FTO可通过调控m6A水平进而影响靶mRNA的降解或翻译，使小鼠条件恐惧记忆增强。这表明mRNA甲基化可能是调控记忆能力的一个普遍机制。

图1 FTO在大脑不同区域分布图Fig 1 Distribution of FTO in different regions of the brain

2.4 调节神经发育

FTO调节神经元发育的途径主要通过参与调控下游mRNA加工代谢的各个过程，包括mRNA的加工、翻译和降解等[23]。谷氨酸是中枢神经系统中含量最丰富的兴奋性神经递质，几乎存在于所有神经元中，它具有去极化神经元和诱导同步放电的功能。谷氨酸的功能主要通过离子型N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体发挥。NMDAR1是一种离子型谷氨酸受体，NMDAR1高表达会损害神经元并导致其凋亡。多巴胺能神经元细胞中FTO水平上升，m6A修饰下降，可增强NMDAR1 mRNA的稳定性，导致多巴胺能神经元细胞凋亡[24]。神经元轴突内的FTO能对轴突部位特定mRNA上的m6A进行去甲基化修饰，在轴突内对Fto进行特异性抑制或沉默会导致靶基因GAP-43的m6A/mRNA修饰水平升高，进而影响GAP-43mRNA的翻译，导致GAP-43减少和抑制轴突延长。可见FTO能改变靶mRNA的m6A修饰，进而影响靶mRNA的翻译和功能执行[25]。综上所述FTO参与下游mRNA加工过程可能是m6A修饰参与神经元发育的普遍模式。

3 问题与展望

尽管众多学者对FTO进行了深入探索，但其具体作用机制仍未明了，比如：1)由于技术的限制，大多数研究对整体RNA进行了检测，但并未区分不同的RNA类型，也未说明在m6A作用过程中FTO是否存在底物种类的偏好性或特异性；2)在大多数的结构研究中认为FTO的作用位点是m6A，但最近有学者提出FTO似乎优先作用于2′-O-二甲基腺苷(m6Am)，这就需要更加精准的检测手段确定其具体的作用位点；3)在目前已经发现的甲基化酶、去甲基化酶中，FTO可单独作用还是需要与其他甲基化酶协同作用以发挥其功能仍待探究。相信这些问题的解决将加深人们对FTO的认识，为深入了解发育过程、开发药物或治疗疾病提供更加有效的手段。