大果木姜子挥发油的提取工艺优化、成分分析及抗氧化活性

刘 杰，郭江涛，刘 耀，程 纯，黄 凯，简梨娜，徐 剑,，张永萍,

（1.贵州中医药大学药学院，贵州贵阳 550025；2.国家苗药工程技术研究中心，贵州贵阳 550025；3.贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州贵阳 550025）

大果木姜子（Merr.）为樟科樟属植物米槁（C）的干燥成熟果实，又名毛丹母、青吐木等，主要分布在我国贵州、广西、云南等西北地区。大果木姜子为药食两用植物，贵州民间多直接将其腌制做泡菜食用。大果木姜子油不仅可以用于调味、去腥，起到健脾开胃的效果，还具有抗心绞痛、抗肿瘤、抗炎镇痛、抑菌等药理作用，近年来陆续有相关制剂如：理气活血滴丸、心胃丹胶囊、米槁心乐滴丸、米槁精油滴丸上市。研究表明挥发油类成分是大果木姜子的活性成分，且有报道挥发油类成分具有极好的抗氧化作用，可作为潜在的天然抗氧化剂使用，但目前并无大果木姜子挥发油抗氧化作用的相关报道。

挥发油常用的提取方法包括水蒸气蒸馏法、超临界CO萃取法及超声辅助提取法，其中，水蒸气蒸馏法因不使用有机溶剂、不会对提取得到的挥发油造成污染、成本低等优点，仍是使用最为广泛的经典方法，但参考文献中采用水蒸气蒸馏法提取大果木姜子挥发油得率均较低，造成了大果木姜子植物资源的浪费。基于此，本实验以大果木姜子为原料，采用水蒸气蒸馏法提取其挥发油，利用响应面法优化提取工艺，同时采用气相色谱-质谱法（GCMS）对最优工艺提取得到的挥发油进行成分及相对含量分析，并探讨大果木姜子挥发油清除DPPH·的活性，以期为大果木姜子挥发油的充分利用及在抗氧化方面的研究及开发利用奠定基础，为大果木姜子的合理开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大果木姜子（Merr.）贵州省黔西南州册亨县双江镇林木村，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定，该品为樟科樟属植物米槁（C）的干燥成熟果实；维生素C（纯度≥99.0%）成都第一制药有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，纯度≥97.0%）梯希布（上海）化成工业发展有限公司；无水乙醇（乙醇质量分数≥99.7%）天津市富宇精细化工有限公司。

6890-5975C 型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；TU-1810 型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；JM·A1002 型电子天平 余姚纪铭称重校验设备有限公司；RRH-A1000 型高速多功能粉碎机 上海绿沃工贸有限公司，RE-2000A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；ZNHW 型数显电热套 上海力辰邦西仪器科技有限公司；GG-17 挥发油测定器 蜀牛玻璃仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大果木姜子挥发油的提取 按2020 版《中国药典》（四部）通则2204“挥发油测定法甲法”提取大果木姜子挥发油。取供试品20 g，粉碎至颗粒度为35 目，以水为提取溶剂在一定料液比下浸泡一段时间，在一定的电热套功率下提取一定时间后，静置1 h，于挥发油测定器下端缓慢放掉水层，于水油交界处开始收集挥发油，以13000 r/min 离心10 min 使油水分离后，采用移液枪吸取上层油相，即得大果木姜子挥发油。

1.2.2 大果木姜子挥发油提取工艺的单因素实验

1.2.2.1 浸泡时间对得率的影响 精密称取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比为1:7（g/mL），浸泡时间分别为0、1、2、3、4、5 h，在电热套功率为100 kW下提取8 h，静置1 h 后分离挥发油，考察浸泡时间对挥发油得率的影响。

1.2.2.2 提取功率对得率的影响 精密称取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比为1:7（g/mL），浸泡3 h，分别在电热套功率为60、100、140、180、220 kW 下提取8 h，静置1 h 后分离挥发油，考察不同提取功率对挥发油得率的影响。

1.2.2.3 料液比对得率的影响 精密称取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比分别为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7（g/mL），浸泡3 h，在电热套功率为100 kW 下提取8 h，静置1 h 后分离挥发油，考察不同料液比对挥发油得率的影响。

1.2.2.4 提取时间对得率的影响 精密称取35 目大果木姜子粉末20 g，料液比为1:7（g/mL），浸泡3 h，在电热套功率为100 kW 下提取，提取时间分别为2、4、6、8、10、12 h，静置1 h 后分离挥发油，考察不同提取时间对挥发油得率的影响。

1.2.3 响应面优化试验 大果木姜子中油类成分含量高，物料颗粒过细将无法过筛，故固定物料颗粒度为35 目。选取浸泡时间（A）、料液比（B）和提取时间（C）作为Box-Behnken试验设计的3 个因素，以大果木姜子挥发油得率为响应值，结合响应面法的设计原理，设计三因素三水平的响应面试验，因素水平表见表1。

表1 大果木姜子挥发油响应面因素水平表Table 1 Response surface factor level table of the volatile oil of Litsea lancilimba Merr.

1.2.4 大果木姜子挥发油得率的计算 设定挥发油质量为m，药材样品质量为m。大果木姜子挥发油得率按下式计算：

式中：W 表示大果木姜子挥发油得率，%；m表示大果木姜子挥发油重量，g；m表示大果木姜子重量，g。

1.2.5 GC-MS 分析条件 色谱条件：色谱柱为HP-5 MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温70 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至190 ℃，以10 ℃/min 升温至310 ℃，运行时间：54 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压18.34 psi，载气流量1.0 mL/min；分流进样，分流比：50:1；溶剂延迟时间：6 min。

质谱条件：离子源为EI 源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1953 V；接口温度280 ℃；质量范围29～500 amu。

1.2.6 DPPH 自由基清除试验 将大果木姜子挥发油用无水乙醇配制成浓度为0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 mg/mL 八个浓度，各取2 mL，加入0.080 mg/mL的DPPH·贮备液2 mL，摇匀，避光静置30 min 后，以无水乙醇为参比液，测定反应体系在波长517 nm处的吸光度（A），同时测定2 mL DPPH·溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度（A）及2 mL 试样液与等体积无水乙醇混合液的吸光度（A），维生素C 作为阳性对照（浓度分别为0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 μg/mL）。

DPPH 自由基清除率按下式来计算：

1.3 数据处理

采用Excel 2010、SPSS 23.0、Prism 8.0.1 进行数据统计分析，0.05 表示差异显著，0.01 表示差异极显著，所有数据均表示为平均值±标准差。Design-Expert V8.0.6 软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 浸泡时间对得率的影响 结果见图1：不同浸泡时间下挥发油得率存在显著性差异（＜0.05）。浸泡时间在0～3 h 之间时，挥发油得率随着时间的延长而增加，2 h 和3 h 之间存在显著性差异；当浸泡时间≥3 h 时，挥发油的得率达到最高，为10.44%，各组之间无显著性差异，得率不再随时间的延长而增加。可能是由于此时浸提液已经达到饱和状态，再继续浸提会使杂质成分溶出，与挥发油竞争溶出空间导致得率下降。考虑到实验时间及成本，故在做响应面试验时，选取浸泡时间为0、2.5 和5.0 h 三个水平。

图1 浸泡时间对大果木姜子挥发油得率的影响Fig.1 Effect of soak time on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.2 提取功率对得率的影响 结果见图2：电热套不同提取功率下挥发油得率无显著性差异（＞0.05）。当电热套提取功率＞100 kW 时，挥发油得率呈现逐渐降低的趋势，可能是随着提取功率的增大，局部提取温度升高，导致部分挥发油成分被破坏，得率下降。但总体变化较小，表明提取功率对挥发油得率的影响不大。因此后续实验固定提取功率为100 kW。

图2 提取功率对大果木姜子挥发油得率的影响Fig.2 Effect of extraction power on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.3 料液比对得率的影响 结果见图3：不同料液比下挥发油得率存在显著性差异（＜0.05）。随着料液比的增加，挥发油的得率出现先增加后减小的趋势。当料液比为1:5、1:6 g/mL 时，挥发油的得率达到最高，继续增加料液比，挥发油的得率呈现下降趋势，可能是因为在一定的料液比范围内，挥发油的浸出传质系数升高，但当料液比过大时，反而减慢了挥发油的扩散速度。结合实际情况，在做响应面试验时，选取料液比1:2、1:4 和1:6 g/mL 作为三个水平。

图3 料液比对大果木姜子挥发油得率的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.1.4 提取时间对得率的影响 结果见图4：不同提取时间下挥发油得率存在显著性差异（＜0.05）。随着提取时间的增加，得率逐渐增加。当提取时间为8 h时，增幅变缓；当提取时间≥10 h 时，得率不再增加，可能是因为此时挥发油溶液趋于饱和，继续提取反而导致挥发油中的成分损失。考虑到提取时间为8 h后的得率增幅较小，结合实际提取成本，选取浸泡时间6、8 和10 h 作为三个水平。

图4 提取时间对大果木姜子挥发油得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面优化结果及分析 以浸泡时间、料液比和提取时间为自变量，大果木姜子的挥发油得率为因变量，采用Design-Expert 软件对各因素回归分析，以确定大果木姜子挥发油的最优提取工艺，结果见表2。

表2 大果木姜子挥发油响应面试验设计与结果Table 2 Response surface experiment design and results of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

2.2.2 响应面方差结果分析 模型＜0.01，表明回归模型极显著。失拟项＞0.05，表明失拟项不显著。从值可以看出，在所选的各因素水平范围内，料液比对挥发油得率的影响最大，提取时间影响次之，浸泡时间的影响最小。在此模型中，一次项B、二次项A、B和C、交互项AC 对结果影响极显著（＜0.01），一次项A、C 对结果影响显著（＜0.05），其他各项均对试验影响不显著，提示各试验因子与响应值不是简单的线性关系。对各因素进行拟合，得到二次回归方程：Y=10.27+0.30A+0.39B+0.32C+0.16AB-0.49AC+0.23BC-0.51A-0.85B-0.60C。模型中回归方程的决定系数=0.9536，校正测定系数adj=0.8939，说明模型精确度高，试验设计可靠，可准确地对试验结果进行预测和分析，变异系数CV=2.87%，表明试验结果与真实值存在2.87%的偏差，模型可靠性较高。噪音信号比为10.824（＞4），说明本模型能真实地反映实验结果。结果见表3。

表3 大果木姜子挥发油响应面方差分析Table 3 Response surface variance analysis of volatile oil of Litsea lancilimba Merr.

2.2.3 因素间的交互作用 三维响应面图曲线越陡，显示得率受该因素影响越大；反之，曲线越缓，表明得率受该因素影响越小。等高线图椭圆表示该两两因素对实验结果影响较重，若较圆的话则影响较小。由图5 可见浸泡时间和提取时间的等高线图呈椭圆形，三维响应面图曲线较陡，表明二者的交互作用对得率的影响明显。提取时间与料液比交互作用对挥发油得率的影响次之，料液比和浸泡时间交互作用对挥发油得率的影响最小。

图5 各两因素交互影响挥发油得率的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface diagram and contour diagram of the interaction of two factors affecting volatile oil yield

2.3 大果木姜子挥发油提取工艺的验证

通过Design-Expert 8.0.6 对回归方程求解，结合实际生产需要确定大果木姜子挥发油的最佳提取条件为浸泡时间5 h，料液比1:5 g/mL，提取时间8 h，此条件下得率的理论值为10.15%。按照上述响应面软件分析的大果木姜子挥发油的最佳提取工艺平行提取5 次，其得率分别为10.64%、10.80%，10.54%、11.08%、10.29%，平均得率为10.67%，与预测值10.15%差距较小，RSD 为0.29%，表明该实验提取工艺稳定可靠。

2.4 GC-MS 分析大果木姜子挥发油成分

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist 17 和Wiley 275 标准质谱图，确定各化学成分，用峰面积归一化法测定各化学成分的相对质量分数。大果木姜子挥发油中共分离得到81 个化合物，最终鉴定出74 个化合物，主要包括烃类（27 种）、醇类（19 种）、酮类（10 种）、酯类（4 种）、醛类（3 种）、萜类（3 种）、酸类（2 种）、酚类（2 种）、其它（4 种），占总挥发油的93.175%。总离子流图见图6，分析结果见表4。

图6 大果木姜子挥发油GC-MS 总离子流图Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

表4 大果木姜子挥发油化学成分及含量Table 4 Chemical constituents and contents of Litsea lancilimba Merr.volatile oil

续表 4

由大果木姜子挥发油各成分相对含量可知以烃类（23.729%）、萜类（22.129%）、醇类（16.77%）、酸类（16.627%）成分为主。其中1,8-桉叶素的含量达到了21.854%，其它相对含量高于3%的分别为正癸酸（12.893%）、-蒎烯（4.873%）、对伞花烃（4.579%）、-蒎烯（4.452%）、月桂酸（3.734%）、-萜品烯醇（3.188%）。文献报道1,8-桉叶素、月桂酸、-蒎烯均具有抑菌作用，其中月桂酸及其酯类是食品和化妆品中最有效的抗菌剂。-萜品烯醇则具有平喘抗炎的效果。本研究采用水蒸气蒸馏法提取得到的大果木姜子挥发油中1,8-桉叶素、月桂酸、-蒎烯含量明显高于其它文献所报道（其它文献报道1,8-桉叶素最高含量为9.87%，月桂酸最高含量为3.184%，-蒎烯最高含量为1.012%），上述分析表明该产地大果木姜子挥发油可能具有较好的抑菌平喘效果。

2.5 大果木姜子挥发油成分的DPPH 自由基清除能力

不同浓度的大果木姜子挥发油对DPPH 自由基的清除率见图7。结果表明大果木姜子挥发油抗氧化活性随质量浓度的增加而逐渐升高，在质量浓度达到6.0 mg/mL 后对DPPH 自由基清除率的增幅变缓，当质量浓度为10.0 mg/mL 时，样品清除率为95.80%，此时的抗氧化能力接近于质量浓度为6 μg/mL 的V。采用Prism 8.0.1 计算得其IC值为0.2434 mg/mL，结果表明大果木姜子挥发油对DPPH 自由基具有较好的清除能力，说明其具有一定的体外抗氧化活性。有文献报道，1,8-桉叶素、-蒎烯等均具有较高的抗氧化活性，推测这些成分可能与大果木姜子挥发油的抗氧化活性有一定的关系。

图7 大果木姜子挥发油及维生素C 对DPPH·的清除作用（n=3）Fig.7 DPPH·scavenging test results of Vc and Litsea lancilimba Merr.volatile oil (n=3)

3 结论

本实验采用响应面法确定了大果木姜子挥发油最优提取工艺为浸泡时间5 h，料液比1:5 g/mL，提取时间8 h，得率可达10.67%，与理论值比较无显著性差异，表明该提取工艺稳定可行，提高了大果木姜子挥发油的得率。对该产地的大果木姜子挥发油化学组成及相对含量进行了分析，共鉴定了74 种成分，占总挥发油量的93.175%，主要为烃类（23.729%）、萜类（22.129%）、醇类（16.77%）、酸类（16.627%），为后续大果木姜子挥发油生物活性研究提供了依据。抗氧化作用研究表明大果木姜子挥发油对DPPH 自由基的具有较好的清除作用，具有一定的抗氧化活性。后续将继续对大果木姜子挥发油进行更为全面的抗氧化作用研究，同时进行量效相关性分析，以期得到具有较强抗氧化作用的天然活性成分。