轻度发酵对沙棘汁挥发性香气成分的影响

吴 斌，姜 蕾，候吉超，宋晶晶，吴江超

（1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆 喀什 844000）

0 引言

沙棘即醋柳、酸刺，是一种富含维C[1]、氨基酸和胡萝卜素[2]的胡颓子科植物（Hjppophae rhamnoides L.）的成熟果实，除了丰富的营养物质之外，还具有较为广泛的药用价值，可用于治疗心脏病、心血管疾病[3]，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀[4]、增强免疫力、抗肿瘤、抗癌[5]等功效，其食药同源的特性也在食品和保健品开发领域得到广泛重视，但沙棘汁由于存在不愉快气味而很少被人接受，因此采取方法改善其风味势在必行。酒精发酵是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）将糖转化为酒精、高级醇和少量甘油、CO2的过程[6]，酵母菌通过自身发酵特性和代谢赋予发酵制品不同的品质[7]和风味[8]。目前，有研究采用酿酒酵母轻度发酵了沙棘汁，优化了发酵工艺，以改善沙棘汁的风味[9]，但轻度发酵对风味成分的具体影响尚不明确。

以新鲜沙棘汁为原料，通过使用酵母菌轻度发酵沙棘汁改善其风味，旨在通过轻度酒精发酵改善其不良气味，探究轻度发酵对沙棘汁风味的影响，用商业酿酒酵母轻度发酵沙棘汁，通过HS-SPMEGC-MS技术检测沙棘汁发酵前后的挥发性香气成分，结合聚类分析和显著性差异分析轻度发酵对沙棘汁的主要挥发性香气成分的影响，以期开发一款大众接受的轻度发酵沙棘汁饮料，促进沙棘产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘原汁，购自新疆维吾尔自治区喀什市，包装完整无损坏，原汁无变质现象。

AWRI-796型活性干酵母，澳大利亚Mauribrew公司提供；果胶酶、偏重亚硫酸钾，法国Lallemand公司提供；2-辛醇，上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头，美国Supelco公司产品；HP-INNOWax毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、QP2020 NX型气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司产品；C-MAG HS 4型磁力搅拌器，德国IKA公司产品；顶空固相萃取装置，美国Sigma公司产品。

1.3 轻度发酵沙棘汁

参考孙乾坤等人[9]的方法，配置3%葡萄糖的蒸馏水，煮沸冷却至30℃后加入活性干酵母并恒温搅拌，直至溶液中有气体产出表明活化完成，调整菌浓度为1×106CFU/mL。添加白砂糖将沙棘汁的糖度调整为10 °Bx，原汁与水1∶1混合，然后向沙棘汁中加入50 mg/L SO2，随后按照果汁质量的0.03%添加活化好的酿酒酵母，于28℃下恒温发酵24 h。

1.4 挥发性香气物质测定

1.4.1 香气物质的提取

样品香气物质的提取主要参考余欢等人[10]的方法，取沙棘汁5 mL置于20 mL顶空瓶中，加入质量浓度为100 μg/mL的2-辛醇2 μL作为内标，密封顶空瓶并于45℃下加热10 min，将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于45℃下吸附40 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃下解析5 min，进行GC-MS分析。

1.4.2 色谱条件

GC-MS分析主要参考PLESSAS等人[11]的方法，采用恒定流量模式，起始柱温40℃，以5℃/min升至90℃；再以10℃/min升至230℃，保留7 min。载气为纯度99.99%的氦气，流量0.8 mL/min，汽化室温度230℃。

1.4.3 质谱条件

电子电离（Electronionization，EI）离子源，电子能量70 eV，接口温度为250℃，离子源温度为200℃，灯丝发射电流为100 μA，检测器电压1 kV。

1.4.4 挥发性物质的定性和定量分析

定性方法：通过比较质谱与NIST15质谱数据库来鉴定化合物，保留正、反匹配度均大于800（最大值为1 000）的鉴定结果。

定量方法：采用直接内标法定量，以2-辛醇作为内标（100 μg/mL），计算公式为：

式中：Cx——各组分香气质量浓度，μg/L；

C1——内标物的质量浓度，μg/L；

M1——待测组分的峰面积；

M2——内标物的峰面积；

V1——内标物体积，mL；

V2——样品体积，mL。

1.5 数据处理

使用Origin Pro 2017软件作图、SPSS 23.0软件进行香气物质组间显著性差异分析（Duncan检验，p＜0.05）和欧式聚类分析，Microsoft Office 2016进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 发酵前后沙棘汁挥发性香气物质的组成

沙棘汁发酵前后挥发性香气成分总离子流图见图1，沙棘汁发酵前后香气物质质量浓度比较见图2，沙棘汁发酵前后挥发性香气物质见表1。

图1 沙棘汁发酵前后挥发性香气成分总离子流图

图2 沙棘汁发酵前后香气物质质量浓度比较

在发酵前后的沙棘汁中共鉴定出68种挥发性香气物质，其中包括29种酯、13种醇、15种酸、6种醛、2种酮、3种酚。由此可见，沙棘汁中主要挥发性物质为酯类，其次是酸类和醇类。在发酵前，共检测出64种挥发性香气物质，其中包括29种酯、13种醇、11种酸、6种醛、2种酮、3种酚。而在发酵后的沙棘汁中，共检测出62种挥发性香气物质，其中包括23种酯、13种醇、15种酸、6种醛、2种酮、3种酚。从总体香气物质质量浓度来看，经发酵后的沙棘汁酯类香气成分质量浓度（11 747.53 μg/L）和醇类香气成分质量浓度（5 416.75 μg/L）比发酵前有所提升，但也损失6种酯类化合物，而且还新增加了4种酸类化合物，包括异丁酸、苯甲酸和2-羟基肉桂酸等。

2.2 发酵对沙棘汁香气成分的影响分析

2.2.1 酯类化合物

酯类物质对酒类的花果香气具有主要贡献[12]。由图2和表1可知，在沙棘汁样品中共检出29种酯类物质，其中发酵前沙棘汁29种，发酵后沙棘汁23种，相较于发酵前沙棘汁（10 273.99 μg/L），发酵后沙棘汁（11 747.53 μg/L）酯类物质总含量均显著升高。主要表现为乙酸乙酯、己酸乙酯和苯甲酸乙酯含量的上升及物质组成的差异，其中乙酸乙酯可赋予沙棘汁微带果香的酒香气味，己酸乙酯具有草莓、菠萝香气，苯甲酸乙酯具有依兰和热带花香，增加了沙棘汁水果类香气强度。同时，经过发酵后的沙棘汁酯类香气物质种类减少了6种，分别是戊酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、肉桂酸乙酯、异戊酸异戊酯、己酸丙酯和2-糠酸乙酯，降低了沙棘汁的香气多样性，减少的酯类香气物质总质量浓度为27.69 mg/L，对总体香气强度的影响较小。

表1 沙棘汁发酵前后挥发性香气物质

（接表1）

2.2.2 醇类化合物

酿酒酵母在酒精发酵过程中通过自身代谢生成酒精的同时会产生甘油和高级醇等副产物[13]，其中高级醇对酒类的风味具有重要作用，当质量浓度大于400 mg/L时，会有强烈的刺鼻味，而当质量浓度小于300 mg/L时，可以使香气更具复杂性[12]。由图2和表1可知，在沙棘汁样品中共检出13种醇类物质，总质量浓度均小于300 mg/L，相较于发酵前的沙棘汁，轻度发酵后的沙棘汁的高级醇含量均显著增加，主要表现在乙醇、异戊醇和苯乙醇含量的增加。其中，异戊醇含量质量浓度从102.13 μg/L上升至198.55 μg/L，乙醇质量浓度从804.35 μg/L上升至1 589.75 μg/L，苯乙醇质量浓度从1 107.75 μg/L上升至1 570.47 μg/L，分别上升94.4%，97.6%，41.8%。其中，乙醇赋予了沙棘汁发酵酒香，适量的异戊醇可以增加沙棘汁的醇厚感。苯乙醇可以赋予沙棘汁玫瑰和蜂蜜气味，同时也是威代尔冰酒的特征香气[14]。

2.2.3 酸类化合物

沙棘汁中的酸类物质主要来源于沙棘果实和酒精发酵代谢，其中脂肪酸是主要的酸类物质，当脂肪酸气味活度值小于1时，可以加强风味复杂性[15]。由图2和表1可知，在沙棘汁中共检测出15种酸类物质，其中发酵前沙棘汁11种，发酵后沙棘汁15种，从酸类物质总质量浓度角度来看，发酵前和发酵后沙棘汁差异不显著，但轻度发酵也具有一定的降酸作用。但相较于发酵前沙棘汁，发酵后沙棘汁酸类化合物增加了4种酸类化合物，分别是异丁酸、反式-己二烯二酸、2-羟基肉桂酸和苯甲酸，多样的酸类物质有利于沙棘汁口感的平衡。但经过轻度发酵后的沙棘汁，辛酸质量浓度显著上升，从发酵前的140.83 μg/L上升至219.77 μg/L，上升56.1%，会给酒类带来酸败的味道，对酒类风味具有一定负面的影响。

2.2.4 醛类化合物

醛类物质主要来源于酒精发酵过程氨基酸在酶的作用下产生的醛。由图2和表1可知，在沙棘汁样品中共检出6种醛类物质，相较于发酵前沙棘汁（179.43 μg/L），发酵后的沙棘汁（51.50 μg/L）中的醛类物质质量浓度显著降低，主要表现在2,4-二甲基苯甲醛、壬醛和呋喃甲醛质量浓度的降低，其中2,4-二甲基苯甲醛具有苦杏仁味，壬醛具有脂肪和牛奶气味，呋喃甲醛具有杏仁气味，降低了沙棘汁的气味强度，但同时醛类物质含量的降低也增加了发酵沙棘汁的安全性，更有益于人体健康。

2.2.5 酮和酚类化合物

由图2和表1可知，在沙棘汁样品中，共检出3种酚类和2种酮类，从发酵前后两类香气物质含量和种类上来看，轻度发酵对沙棘汁的酮和酚类影响不大，总质量浓度从发酵前的76.26 μg/L上升至发酵后的77.47 μg/L，仅上升1.6%，因此轻度发酵对改善沙棘汁醛类风味物质贡献较小。

2.3 沙棘汁发酵前后香气物质聚类分析

沙棘汁发酵前后香气物质聚类分析树状图见图3。

采用聚类分析评估发酵前和发酵后沙棘汁中挥发性化合物的变化。通过SPSS 16.0分析软件，以类间平均距离法作为测量方法，以欧式距离作为度量标准，将发酵沙棘汁和未发酵沙棘汁样品风味物质聚类成树状图。由图3可知，发酵沙棘汁和未发酵沙棘汁样品分别被准确聚为一类：一种聚类对应于发酵前的沙棘汁样品（before）；另一种聚类对应于发酵后的沙棘汁样品（after）。当欧式距离增大至25.0时，发酵样品和未发酵样品才被聚为一类，说明发酵样品和未发酵样品之间相似度极低。表明发酵前和发酵后的整体挥发性风味轮廓不同，经酵母菌发酵后的沙棘汁风味改变显著。

3 结论

通过对轻度发酵前后沙棘汁的挥发性香气物质进行检测分析，共检出68种挥发性香气物质，其中包括29种酯、13种醇、15种酸、6种醛、2种酮、3种酚。与发酵前沙棘汁相比，经过轻度发酵能够显著增加沙棘汁酯类香气物质，主要是乙酸乙酯、己酸乙酯和苯甲酸乙酯，增强沙棘汁花果类香气；轻度发酵后的醇类物质含量也高于发酵前沙棘汁，表现为苯乙醇、异戊醇和乙醇等高级醇含量的上升，赋予沙棘汁厚重的口感和玫瑰类香气。同时，经过发酵新产生了4种酸类物质，有利于平衡沙棘汁的口感，降低了醛类物质的含量，提高了沙棘汁的安全性。因此，研究认为轻度发酵能够显著改善沙棘汁的风味和口感，后续工作可对轻度发酵沙棘汁工艺进行更深层次的优化，开发一款受大众接受和喜爱的轻度发酵沙棘汁饮料。