蓝莓果渣中总黄酮的提取工艺优化

张 齐，张圣煜，王俊颖

（安徽科技学院食品工程学院，安徽 凤阳 233100）

蓝莓的果肉及果壳在食品研发的过程中具有很高的营养价值[1]，其蛋白质、脂肪、碳水化合物、维C含量丰富，除此之外，类黄酮、花青素、多酚类也包含其中。随着蓝莓果汁和果酱产品的发展与衍生，在其生产过程中产生了许多蓝莓果渣[2-5]。关于此类工艺对蓝莓果渣利用率不高，但是蓝莓果渣中可用物质非常多，如果能提高果渣利用率，不仅可以节约资源，也可以避免环境污染，是学术界和产业界应该尽快解决的问题[6-8]。

黄酮类化合物有2种存在方式，其一是游离的苷元，其二是与糖等结合的苷[9-11]。类黄酮具有很好的医学功效，是一种抗氧化剂，有改善血液循环、降低胆固醇、减少心肌氧耗氧量、明显缓解心搅拌痛、预防心肌梗塞和心律失常的效果[12-14]。作为健康食品的一种功能因子被列举出来。因此，为了蓝莓副产物得到充分利用，提高综合使用价值，此试验以蓝莓果渣作为原料，采用超声波辅助的提取方法研究蓝莓果渣中的类黄酮物质，同时也为蓝莓工业化生产黄酮类化合物提供一定的试验数据[15]。

当今社会，人们对食品质量的要求越来越高，尤其是对延缓衰老、美容保健等功能食品的需求加大[16-17]。蓝莓果渣中含有的总黄酮具有延缓细胞衰老、抗癌的功能，是一种天然的抗氧化剂[18]。因此，蓝莓果渣产品的开发及功能活性的研究，具有很高的社会效益和经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓果渣（制作蓝莓果汁饮料及果酒所剩的残渣）；无水乙醇、芦丁标准品。

1.2 仪器与设备

紫外可见光分光光度计，上海光谱仪制造有限公司产品；超声波辅助清洗器，昆山超声波设备有限公司产品；电子天平，上海浦春计量仪器有限公司产品；离心机，上海天美科学仪器有限公司产品；万能粉碎机，上海隆拓仪器设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

蓝莓果渣黄酮提取过程如下：

蓝莓果渣→洗净烘干→粉碎→超声波辅助提取（乙醇浸提）→离心过滤→紫外分光光度计检测。

1.3.2 测定指标与方法

测定指标：蓝莓果渣总黄酮提取率。

测定方法：具体步骤如下：

（1）称取干燥的蓝莓果渣粉末3.0 g，使用体积分数65%的乙醇溶液浸提蓝莓果渣粉末，超声波辅助提取。

（2）设置离心机参数，以转速5 000 r/min离心15 min，放入提取液，离心后保留上清液。

（3）设置分光光度计参数，波长为510 nm，将空白对照组与样品置于其中，测定其吸光度A。

1.3.3 标准曲线的绘制

标准曲线绘制图过程如下：

（1）称取10 mg芦丁标准品溶解于体积分数75%的乙醇溶液，定容于50 mL容量瓶中。

（2）将样品均分为6份，称量6组芦丁标准品，体积分别为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分别置于25 mL容量瓶，加入5%的亚硝酸钠溶液1.00 mL，摇匀静置6 min；再加入10%硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀静置6 min；最后加入4%的氢氧化钠溶液10 mL，用体积分数75%的乙醇定容，摇匀，放置15 min[19]。

（3）和空白组对照一起置于波长510 nm处测定吸光度。

根据试验数据，作出标准的芦丁回归曲线及方程，蓝莓果渣中总黄酮提取率（Y）的计算公式为：

式中：Y总——蓝莓果渣总黄酮的提取率，%；

V总——提取液的总体积，mL；

m——称取的蓝莓果渣粉的质量，mg；

C——样品提取液中蓝莓果渣总黄酮的质量浓度，mg/mL。

2 试验方法

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

取5份蓝莓果渣粉，每份3.0 g。根据工艺流程，在料液比为1∶20，超声温度为70℃，超声时间2 h固定的条件下。改变乙醇体积分数，设置5个水平分别为45%，55%，65%，75%，85%，分组进行试验，测定不同的乙醇体积分数对工艺的影响，得出最佳乙醇体积分数。

乙醇体积分数因素与水平设计见表1。

表1 乙醇体积分数因素与水平设计/%

2.1.2 料液比对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

取5份蓝莓果渣粉，每份3.0 g。根据工艺流程，在乙醇体积分数为65%，超声温度为70℃，超声时间2 h固定的条件下。改变提取料液比，设置5个水平分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，分组进行试验，测定不同比例的料液比对工艺的影响，得出最佳的料液比。

料液比因素与水平设计见表2。

表2 料液比因素与水平设计/g∶mL

2.1.3 超声时间对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

取5份蓝莓果渣粉，每份3.0 g。根据工艺流程，在料液比1∶20，乙醇体积分数65%，超声温度70℃固定的条件下。改变超声时间，设置5个水平分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，分组进行试验。测定不同的超声时间对工艺的影响，得出最佳超声时间。

超声时间因素与水平设计见表3。

表3 超声时间因素与水平设计t/h

2.1.4 超声温度对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

取5份蓝莓果渣粉，每份3.0 g。根据工艺流程，在料液比1∶20，乙醇体积分数为65%，超声时间为2 h固定的条件下。改变超声温度，设置5个水平为55，60，65，70，75℃，分组进行试验。测定不同的超声温度对工艺的影响，得出最佳超声温度。

超声温度因素与水平设计见表4。

表4 超声温度因素与水平设计 θ/℃

2.2 响应面试验

采用Design Expert 12.0软件对试验数据进行分析处理。以3个影响因素作为试验参数，设计出方案和变量水平。

响应面水平见表5。

表5 响应面水平

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

由图1可知，得到回归方程的公式为：

3.2 单因素试验结果与分析

3.2.1 乙醇体积分数对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

乙醇体积分数对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响

由图2可知，在乙醇体积分数为45%～65%时，随着乙醇体积分数的增加，蓝莓果渣中的总黄酮也在增加，乙醇体积分数为65%时达到最高，提取率为1.62%。除此之外，倘若继续增加乙醇体积分数，蓝莓果渣中所有黄酮的提取率下降，提取率变化不再显著。原因是总黄酮难以溶于水，乙醇体积分数低的情况下，水分含量高，总黄酮的溶出量低。因此，由单因素试验而选取乙醇体积分数为65%。

3.2.2 料液比对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

料液比对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响见图3。

图3 料液比对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响

由图3可知，最佳料液比为1∶20，此时蓝莓果渣中总黄酮提取率最高。从1∶10增加到1∶20时，蓝莓果渣中总黄酮提取率都有上升趋势，1∶20时最多达到最大值1.63%。当料液比从1∶20增加到1∶30时，此时可以看到出现拐点，提取率开始下降。通过分析试验得出结论，主要原因是溶剂量在不断增加，随着总黄酮的浸出量不断增加，蓝莓果渣里的总黄酮的含量有限，所以最后有部分溶于酒精的杂质析出影响了总黄酮的析出。因此在单因素试验的基础上选取料液比为1∶20。

3.2.3 超声时间对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

超声时间对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响见图4。

图4 超声时间对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响

由图4可知，最佳超声时间为2 h，此时蓝莓果渣中总黄酮提取率最高，从0.5 h增加到2 h时，蓝莓果渣中总黄酮提取率都有上升趋势，2 h最多达到最大值1.59%。当时间从2 h增加到2.5 h时，此时可以看到出现拐点，提取率开始下降。经分析可能是因为超声时间的越来越长，原料和溶液的接触时间就越来越多，所以蓝莓果渣中所有黄酮的浸出就越多。因此，由单因素试验的结果可以得出超声时间为2 h为最佳条件。

3.2.4 超声温度对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响

超声温度对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响见图5。

由图5可知，超声温度为55～70℃时，提取率随温度上升而增加，在温度为70℃时总黄酮的提取率在峰值。在温度范围为70～75℃时，随着温度的下降，果渣总黄酮提取率也在下降。在70℃以上提取率降低，这是因为在高温度下所有的黄酮类物质都容易氧化，以至于总黄酮的结构被破坏，提取率会下降。因此，通过单因素试验将超声温度设定为70℃。

图5 超声温度对蓝莓果渣中总黄酮提取率的影响

3.3 响应面试验结果与分析

3.3.1 响应面试验结果

通过单因素的试验结果制定响应面试验水平数据。

响应面水平选取见表6，响应面试验结果见表7，超声提取蓝莓渣中总黄酮提取率二次多项式模型方差分析见表8，超声波提取蓝莓果渣中总黄酮得率回归方程系数显著性检验见表9。

表6 响应面水平选取

表7 响应面试验结果

表8 超声提取蓝莓渣中总黄酮提取率二次多项式模型方差分析

表9 超声波提取蓝莓果渣中总黄酮得率回归方程系数显著性检验

根据Design Expert 12.0软件二次回归分析的结果，得到回归方程为：

根据上述方程式的方差分析表可知，试验所选用模型p＜0.000 1较为明显，失拟项在p=0.258 4＞0.05不显著，R2=0.993 0，R2Adj=0.984 0，由以上分析可得，预测值和试验值之间具有较高的相关性[20]。

3.3.2 响应面试验结果分析

乙醇体积分数和液料比2个因素分析图见图6。

乙醇体积分数和液料比对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响。由图6可知，在时间控制2 h不变时，改变乙醇体积分数和料液比，提取率呈现出先上升后下降。等高线图中乙醇体积分数为65%，料液比为1∶20时，蓝莓果渣中总黄酮达到最高的提取率。

图6 乙醇体积分数和液料比2个因素分析图

乙醇体积分数和超声时间2个因素分析图见图7。

乙醇体积分数和超声时间对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响。由图7可知，控制料液比1∶20条件不变时，超声时间和乙醇体积分数的共同作用影响着总黄酮的提取率。固定超声时间，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率先是上升后是下降，转折体积分数出现在65%。固定乙醇体积分数，增加超声时间，总黄酮提取率趋势与上述相同，先上升后下降，转折时间为2 h。根据等高线图可以看出，乙醇体积分数为65%，超声时间为2 h时，蓝莓果渣中总黄酮提取率达到最高点。

图7 乙醇体积分数和超声时间2个因素分析图

料液比和超声时间2个因素分析图见图8。

料液比和超声时间对蓝莓果渣中总黄酮提取效果的影响。由图8可知，控制乙醇体积分数65%不变时，超声提取时间和料液比的共同作用影响着总黄酮提取率。固定提取时间，增加料液比，总黄酮的提取率呈现先上升后下降的趋势。再通过改变时间而不改变料液比，提取率先上升后下降。等高线图中可以看出料液比为1∶20，超声时间为2 h时，蓝莓果渣中总黄酮提取率达到最高点。

图8 料液比和超声时间2个因素分析图

3.3.3 最佳工艺条件及验证试验

由响应面图分析可知，最佳的参数为乙醇体积分数64.774%，料液比1∶20.475，超声时间2.080 h，通过拟合方程预测得到总黄酮提取率为1.825%。优化试验数据制定验证试验条件为乙醇体积分数64.7%，料液比1∶20.5，超声时间2.1 h，得出蓝莓果渣中总黄酮提取率为1.81%，在该最优提取工艺条件下进行3次验证性试验，与模型预期值基本一致，说明响应面优化试验可行。

优化工艺验证试验结果见表10。

表10 优化工艺验证试验结果/%

4 结论

研究蓝莓果渣总黄酮的提取工艺，通过单因素试验和响应面优化试验的结果得知该模型拟合性良好。经过响应面工艺优化确定出在乙醇体积分数为64.7%，料液比为1∶20.5，超声时间2.1 h，超声温度70℃条件下。此时蓝莓果渣中总黄酮的实际提取率达到最高为1.81%。研究优化了蓝莓果渣中总黄酮提取率的工艺，得到的结果为日后果渣提取工艺提供了一定的试验基础。