培土生金法对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡、膈肌及其线粒体病理形态的影响

冯立志，詹少锋

（1.广州中医药大学第一附属医院心肺康复科，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广东广州 510405）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），是一种常见的呼吸疾病，以气流受限不完全可逆为特征[1]。COPD主要由于气道炎症和黏液纤毛功能障碍，产生气流受限，引起肺功能明显下降，临床主要表现为咳、痰、闷、喘，随着病情加重，逐渐表现为呼吸困难，最终导致活动能力明显下降[2-4]。COPD患者多存在严重的呼吸肌疲劳，这是导致COPD病情逐渐加重，甚至死亡的重要原因之一。如何减少COPD患者呼吸衰竭，增强呼吸肌和膈肌的力量，促进患者康复，成为医学难题。

中医药治疗COPD不仅可以缓解症状，提高临床疗效，缩短住院天数和降低死亡率，而且可以进一步改善患者的生存质量，控制疾病发展，具有良好的应用前景。本研究团队前期相关COPD的研究发现：培土生金法联合西药能改善COPD稳定期外周骨骼肌功能障碍患者的临床症状，提高疗效[5]；培土生金法可改善COPD大鼠肺功能，上调血浆细胞色素C氧化酶（ROC）和神经生长因子（NGF）水平，促进线粒体的氧化代谢[6]。提示培土生金法具有提升肌力，改善线粒体能量代谢，提升肺通气功能的作用。COPD与呼吸肌疲劳密切相关。本研究拟观察培土生金法对COPD大鼠肺、膈肌及其线粒体病理形态的影响，探讨培土生金法对呼吸肌的保护作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物48只SPF级5～7周龄雄性SD大鼠，体质量100～140 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034。动物饲养于广州中医药大学第一附属医院实验动物中心，于12 h光明/12 h黑暗，温度控制在20～26℃，湿度在40%～70%的SPF级别环境中，自由饮水和摄食。适应性饲养1周后开始进行动物实验。实验期间使用的灭菌普通饲料由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物、试剂与仪器地塞米松片（Sigma上海贸易有限公司，批号：D4902）；五指毛桃（金源绿色生命中药饮片有限公司，批号：191102）；太子参（广东至信中药饮片有限公司，批号：191102）；茯苓（广东天诚中药饮片有限公司，批号：190501）；苦杏仁、白术、紫苏子（广东紫和堂大药房有限公司，批号：191207、1912140、1909062）。苏木素染液、伊红染液（谷歌生物公司）；无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。H-7600透射电子显微镜（Hitachi日立公司）；Nikon DS-U3成像系统、光学显微镜（日本Nikon公司）。

1.3 方药组成及制备培土生金法中药复方由五指毛桃24 g、太子参16 g、茯苓12 g、白术9.6 g、苦杏仁8 g、紫苏子8 g组成。中药煎剂制作过程如下：将上方中药材置于8倍温水中浸泡0.5 h，煮沸后文火煎煮4 h，注意均匀搅拌，取汁后经三层纱布过滤；第2次和第3次煎煮均分别以6倍水文火煎煮2 h，同样方法取汁。合并3次药液。根据临床每日成人用药量换算成大鼠用药剂量[7]。浓缩至每毫升含1.8 g（生药）/kg（体质量）作为给药高剂量，稀释2倍后为0.9 g（生药）/kg（体质量）作为给药中剂量，稀释4倍后为0.45 g（生药）/kg（体质量）作为给药低剂量。药液常温冷却后，至4℃冰箱内保存备用。

1.4 分组、造模与给药将48只大鼠随机分成6组，即空白组，模型组，中药高、中、低剂量组和阳性药物组，每组各8只。采用熏吸香烟的造模方法，建立COPD模型[8]。具体方法如下：将大鼠置于自制密闭造模箱（大小50 cm×50 cm×50 cm，木质箱体，透明有机玻璃箱盖，箱体壁留有4个直径1 cm通气孔）内，注入香烟烟雾，30 min/d，整个造模时间为28 d。预取材时观察肺组织病理，发现肺大泡形成提示造模成功[9]。成功造模后分组给药。中药高、中、低剂量组：分别对应给予1.8、0.9、0.45 g（生药）/kg（体质量）培土生金法中药复方灌胃，每天1次；阳性药物组：给予地塞米松0.2 mg/kg灌胃，每天1次；空白组：常规喂养，给予生理盐水灌胃，每天1次，不作其他干预；模型组：给予生理盐水灌胃，每天1次。给药时间共为30 d。禁食12 h，行肺和膈肌组织检测。

1.5 HE染色法观察肺和膈肌组织病理变化①取材：颈椎脱臼处死大鼠后，取出肺和膈肌组织，清洗，滤纸吸干，放入组织固定液中24 h以上。②脱水：75%乙醇4 h-85%乙醇2 h-90%乙醇2 h-95%乙醇1 h-无水乙醇Ⅰ30 min-无水乙醇Ⅱ30 min-50%无水乙醇、50%二甲苯混合液5～10 min-二甲苯I 5～10 min-二甲苯Ⅱ5～10 min-石蜡Ⅰ1 h-石蜡Ⅱ1 h-石蜡Ⅲ1 h。③包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。④切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。⑤石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-无水乙醇Ⅰ10 min-无水乙醇Ⅱ10 min-95%乙醇5 min-90%乙醇5 min-80%乙醇5 min-70%乙醇5 min-蒸馏水洗。⑥苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3～8 min，自来水洗，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。⑦伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1～3 min。⑧脱水封片：将切片依次放入95%乙醇I 5 min-95%乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

1.6 肺泡面积分析采用Image-Pro Plus图像分析软件对肺组织HE染色图片肺泡面积进行测量，并进行统计分析。

1.7 电镜观察膈肌超微结构①取材：组织块1～2 mm3。②固定：冲液配制固定2 h或更长时间。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min，1%锇酸固定液固定2～3 h，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。③脱水：50%乙醇15～20 min，70%乙醇15～20 min，90%乙醇15～20 min，90%乙醇90%丙酮（1∶1）15～20 min。90%丙酮15～20 min以上在4℃冰箱内进行，100%丙酮室温3次，每次15～20 min。④包埋聚合：将浸透后的标本放入包埋胶囊的纯树脂中，70℃12 h。⑤固化：37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12 h，60℃烘箱内48 h。⑥Leica UC 7超薄切片机切片60 nm超薄片。⑦醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色。⑧Hitachi日立H-7600透射电子显微镜观察，拍片。

1.8 统计方法采用Image-Pro Plus图像分析软件和SPSS 19.0统计软件分析。所得数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。若方差齐，组间两两比较采用LSD法；若方差不齐，组间两两比较采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理变化比较图1和表1结果显示：空白组肺组织结构清晰，肺泡结构完整，未见明显肺大泡。与空白组比较，模型组的肺组织结构出现明显破坏，肺大泡明显，肺泡周围伴有炎症细胞浸润。中药各剂量组和阳性药物组的肺组织破坏程度较模型组减轻，肺泡结构基本完整，周围炎症细胞浸润不明显，肺泡腔缩小。提示培土生金法中药复方可保护COPD大鼠肺组织结构，减少肺大泡的形成及炎症渗出。

表1 各组大鼠肺泡面积比较Table 1 Comparison of rat pulmonary alveoli area among various groups （±s）

表1 各组大鼠肺泡面积比较Table 1 Comparison of rat pulmonary alveoli area among various groups （±s）

①P＜0.01，与空白组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别空白组模型组阳性药物组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组鼠数/只888888肺泡面积/μm2 101.63±29.98 251.14±27.81①112.79±18.73②117.85±26.93②126.12±29.30②138.54±29.95②

图1 各组大鼠肺组织病理变化比较（HE染色法）Figure 1 Comparison of the histopathological changes in rat lung tissue among various groups（by HE staining method）

2.2 各组大鼠膈肌病理变化比较图2结果显示，空白组的膈肌组织结构正常，肌纤维纹理清晰，肌细胞排列整齐，间隙正常。与空白组比较，模型组的膈肌组织结构明显破坏，肌纤维纹理紊乱，间隙增大，肌细胞排列不齐。中药各剂量组和阳性药物组的膈肌组织结构大致相似，膈肌纤维纹理整齐有序，间隙正常，可见排列整齐的肌细胞。提示培土生金法中药复方可保护COPD大鼠膈肌组织结构，减少其膈肌肌丝和肌细胞的破坏。

图2 各组大鼠膈肌病理变化比较（HE染色法）Figure 2 Comparison of pathological changes in the rat diaphragm among various groups（by HE staining method）

2.3 各组大鼠膈肌超微结构比较图3结果显示，空白组肌原纤维排列有序，粗细丝的结构清晰，存在明暗相间的横纹带，可见深密度的Z线及H带。另外，在肌原纤维中可见排列整齐的线粒体和糖原颗粒等结构。与空白组比较，模型组的膈肌组织结构明显破坏，肌纤维粗大无序，间隙增大，肌细胞排列紊乱，线粒体缺失破坏，分布明显不均匀。中药各剂量组和阳性药物组的膈肌组织结构大致相似，肌纤维排列有序，走行清晰，间隙正常，可见较多完整的线粒体结构。提示培土生金法中药复方可减轻COPD大鼠膈肌组织和线粒体结构的损伤，对膈肌肌丝和线粒体具有明显的保护作用。

图3 各组大鼠膈肌超微结构比较（透射电镜）Figure 3 Comparison of the ultrastructure of the rat diaphragm among various groups（by transmission electron microscopy）

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病（COPD）归属中医学“肺胀”范畴，病位主要在肺，涉及五脏六腑，其中又以肺脾关系最为密切。中医学认为：肺主气，司呼吸；脾主运化升清。脾通过运化功能，输送水谷精微到全身各组织中，发挥滋润肺组织和膈肌的作用，同时排出代谢水液到体外，从而维持水液的平衡。那么，健脾培土，补土生金，可加强肺主气功能。本研究结果显示，中药各剂量组和地塞米松阳性药物组肺组织病理表现相似，与模型组相比，肺组织结构均明显好转，肺大泡明显减少，肺组织无明显炎症细胞浸润，肺泡基本完整，提示中药培土生金法能够保护COPD大鼠肺组织结构，进而改善肺通气功能，减轻呼吸受阻的症状。

COPD患者往往对呼吸肌的需求增加，呼吸肌的功能储备亦显著降低。膈肌是参与呼吸过程的主要呼吸肌，若膈肌功能异常，会影响正常的呼吸功能，严重的可出现呼吸衰竭，甚至死亡。中医学认为：脾主肌肉。脾通过运化功能可以保持膈肌丰满润泽，增强膈肌收缩力。张立德等[10]以“脾主肌肉”为依据，发现脾气虚家兔肌电图的单位电位波形多为五相以上，波幅降低，时程增大。经健脾治疗后，可让肌肉电波恢复到正常状态[11]。还有研究表明，骨骼肌细胞能量代谢与线粒体密切相关[12]。线粒体是氧化代谢的核心，骨骼肌所需的能量与线粒体的质量密切相关[13]。李乐红等研究[14]发现，脾气虚动物模型体内的骨骼肌线粒体质量发生异常改变，经健脾益气类药物治疗后，其结构可以恢复到接近正常的状态，提示健脾益气类药物具有修复线粒体功能的作用。由此可见，脾-线粒体-肌肉三者关系密切，相互影响。通过益气健脾，提升肌细胞线粒体的质量，直接达到增强肌肉的作用，从而改善呼吸功能[1 5]。本研究结果显示：与空白组相比较，模型组的膈肌组织结构明显破坏，肌纤维粗大无序，间隙增大，肌细胞排列紊乱，线粒体缺失破坏，而中药各剂量组和地塞米松阳性药物组膈肌超微结构表现相似，与模型组相比，肌纤维整齐有序，无明显断裂或变形，肌细胞和线粒体结构完整。结果表明，中药培土生金法可修复C O P D大鼠膈肌组织结构和受损线粒体，进而增强膈肌舒缩功能，提高呼吸功能。

综上所述，通过观察培土生金法对COPD大鼠肺泡、膈肌和线粒体病理变化的影响，验证了培土生金法能改善COPD疾病过程中肺泡、膈肌和线粒体损伤，提示培土生金法具有改善呼吸肌疲劳的作用。此作用机制为培土生金法缓解呼吸肌疲劳，减少发生呼吸衰竭在临床的实际应用提供了科学依据。