高效液相色谱法测定糕点中的富马酸二甲酯和纳他霉素

张慧琼，郑陆红，黄柳霞，陈丽香

（1.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442；3.广东省质量监督食品检验站，广东广州 511442）

糕点食品的保质期较短，在储存、流通过程中易因微生物大量繁殖而引起食品的腐败和变质。生产企业会在生产中添加苯甲酸钠、山梨酸钾、富马酸二甲酯和纳他霉素等防腐剂来保证糕点食品的质量和风味[1]。富马酸二甲酯又称胡索酸二甲酯，化学名为反丁烯二酸二甲酯，俗称防霉保鲜剂霉克星1号。因其高效、持久稳定且应用范围广泛，所以常被用于果蔬食品、服饰、化妆品、中药材等的防腐、防霉、保鲜方面。富马酸二甲酯有毒，对人体有腐蚀性和致过敏性，可经食道吸入对人体肠道、内脏产生腐蚀性损害，尤其对儿童的生长发育造成了重大的危害[2]。纳他霉素又称匹马霉素，能有效抑制各种酵母菌、霉菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生，可广泛用于乳酪、肉制品、糕点等食品的防腐保鲜及真菌治疗[3]。虽然我国将富马酸二甲酯列为第二种违禁食品添加剂，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[4]规定，纳他霉素的最大使用量为0.3 g·kg-1，且为表面使用。但不良厂家、不法商贩为降低成本、延长货期，在月饼、面包等常见的糕点食品中违规使用，因此加强对糕点中富马酸二甲酯和纳他霉素的检测评价是十分重要的。目前国内检测富马酸二甲酯和纳他霉素的标准方法是高效液相色谱法，但是两个项目分别检测，而糕点的检测任务繁重，且富马酸二甲酯的实验过程需要配制多种试剂，耗时长、成本高。因此，本文基于快速简便筛查的目的，研究了同时测定糕点中富马酸二甲酯和纳他霉素的含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌糕点，市售；绿豆糕中富马酸二甲酯含量检测内部质控样品，86.46 mg·kg-1：大连中食国实检测技术有限公司；富马酸二甲酯标准品（纯度99.70%）：Dr.Ehrenstorfer 公司；纳他霉素标准品（纯度91.1%），BePure 公司；甲醇（色谱纯），上海星可高纯溶剂有限公司；实验室用水为Milli-Q Advantage A10 制备的一级水，Millipore 公司；0.22 μm有机相滤膜，艾杰尔。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity II 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD），美国安捷伦科技有限公 司；TC-C18色 谱 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美国安捷伦科技有限公司；超声波清洗机（SB25-12DT），宁波新芝生物科技股份有限公司；漩涡混合器（IKA MS 3 basic），德国IKA 公司；纯水机（Milli-Q Advantage A10），默克密理博公司；电子天平，十万分之一，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 标准储备溶液的配制

精确称取富马酸二甲酯标准物质10.03 mg，用甲醇充分溶解，并稀释定容至10 mL 容量瓶，摇匀，配制成1.000 mg·mL-1的标准储备液，贮存于0 ～4 ℃冰箱中，有效期90 d。

精确称取纳他霉素标准物质10.98 mg，用甲醇充分溶解，并稀释定容至10 mL 容量瓶，摇匀，配制成1.000 mg·mL-1的标准储备液，贮存于0 ～4 ℃冰箱中，有效期90 d。

1.3.2 标准混合使用液的配制

从富马酸二甲酯标准储备液（1.000 mg·mL-1）和纳他霉素标准储备液（1.000 mg·mL-1）中分别吸取1 mL 至同一个10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混匀，配制成100 μg·mL-1的标准混合使用液。

1.3.3 标准系列溶液的配制

从富马酸二甲酯和纳他霉素的标准混合使用液（100 μg·mL-1）中 分 别 吸 取0.004 mL、0.010 mL、0.050 mL、1.000 mL、5.000 mL、10.000 mL、20.000 mL 至100 mL 容量瓶，用甲醇水溶液（75+25，V/V）定 容，配 制 成0.004 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1和20.000 μg·mL-1的标准系列溶液。

1.4 试样前处理

糕点均匀粉碎后，准确称取试样2.00 g，置于50 mL 离心管中，加入75%甲醇15 mL，涡旋摇匀3 min，再置于超声波清洗机中超声提取30 min，再用75%甲醇定容至25 mL，后置于离心机中以4 000 r·min-1，离心5 min，上清液过0.22 μm 有机滤膜，收集滤液约2 mL 供高效液相色谱仪分析测定。

1.5 色谱条件

Agilent TC-C18色 谱 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇与水（70 ∶30，V/V）为流动相，流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，波长210 nm 和304 nm，二极管阵列检测器检测。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

参考相关文献，本实验采用甲醇与水作为流动相[5]，考察了甲醇和水的不同比例，甲醇∶水（V∶V）为90 ∶10、85 ∶15、80 ∶20、75 ∶25、70 ∶30、65 ∶35、60 ∶40、55 ∶45、50 ∶50 和45 ∶55。经过反复的试验，甲醇比例较高时，两者分不开，且响应不高。本试验最终选择甲醇-水70 ∶30 为流动相，能更好地把富马酸二甲酯、纳他霉素洗脱出来，且峰型对称。富马酸二甲酯标准溶液的色谱图见图1，通过与空白样品的比较，其保留时间为3.0 min。纳他霉素标准溶液的色谱图见图2，通过与空白样品的比较，其保留时间为4.6 min。

图1 富马酸二甲酯标准溶液的色谱图

图2 纳他霉素标准溶液的色谱图

2.1.2 检测波长的确认

取10 μg·mL-1富马酸二甲酯和纳他霉素标准储备液，分别采用DAD 在波长190 ～400 nm 进行扫描，结果见图3、图4。富马酸二甲酯的最大吸收波长是210 nm，纳他霉素的最大吸收波长是304 nm。因此，本实验选择210 nm 作为富马酸二甲酯的检测波长，选择304 nm 作为纳他霉素的检测波长。

图3 富马酸二甲酯标准溶液的光谱图

图4 纳他霉素标准溶液的光谱图

2.2 样品提取溶剂的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

富马酸二甲酯溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮和醇类，微溶于乙醚和水；纳他霉素微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸，难溶于大部分有机溶剂。骆健美等[6]采用平衡法测定了纳他霉素在不同溶液中的溶解度，最终发现在甲醇中的溶解效果是最好的。由于糕点基质油脂比较多，且含有丰富的蛋白，若选用甲醇提取，会使溶于甲醇的一些油脂杂质也被带到溶剂中，造成基线波动，又因选用甲醇水作为流动相，官咏仪等[7]也认为选择甲醇水作为此两种物质的提取溶剂，能使上机的溶液浓度更接近流动相。因此，本方法选用甲醇-水作为提取富马酸二甲酯和纳他霉素的溶剂。

2.2.2 提取溶剂比例的确认

参考相关文献[5-6]，本试验采用甲醇-水作为提取溶剂，考察了甲醇和水的不同比例，甲醇∶水（V∶V）为0 ∶100、5 ∶95、10 ∶90、15 ∶85、20 ∶80、25 ∶75、30 ∶70、35 ∶65、40 ∶60、45 ∶55、50 ∶50、55 ∶45、60 ∶40、65 ∶35、70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20、85 ∶15、90 ∶10、95：5 和100 ∶0，对 富 马 酸 二 甲 酯 和纳他霉素的回收率，结果如图5 所示。经过反复的试验，纳他霉素在甲醇水的不同比例中，回收率为72%～105%，但富马酸二甲酯在甲醇比例为70 以下时，回收率均低，在甲醇比例为70 以上时，回收率明显良好。最终在大量试验下，且考虑提取溶液的浓度能更接近流动相。因此，本方法选用75%甲醇作为提取富马酸二甲酯和纳他霉素的溶剂。

图5 甲醇水不同比例分别对富马酸二甲酯和纳他霉素回收率的影响

2.3 方法的线性范围及检出限

在上述分析条件下，将标准系列溶液分别进样10 μL，以标准工作使用液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制校正曲线，富马酸二甲酯的线性回归方程为Y=70.247 5X-2.949 6，相关系数（r）为0.999 91，线性良好；纳他霉素的线性回归方程为Y=30.507 2X-0.485 4，相关系数（r）为0.999 92，线性良好。以信噪比S/N=3 时计算本方法的检出限，S/N=10 时的浓度为定量限，具体见表1。

表1 糕点中富马酸二甲酯和纳他霉素标准样品的标准曲线方程

2.4 方法回收率试验

准确称取不含富马酸二甲酯和纳他霉素的基质样品，分别加入富马酸二甲酯和纳他霉素5 mg·kg-1、125 mg·kg-1、225 mg·kg-13个水平的标准储备溶液，按照“1.4 试样前处理”进行加标回收试验，每个水平做6个平行，测定回收率和精密度，结果见表2。结果表明，富马酸二甲酯的回收率在97%～104%，相对标准偏差在0.71%～0.94%；纳他霉素的回收率在95.1%～99.3%，相对标准偏差在0.20%～0.86%，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F 中回收率和精密度的要求。本研究建立的方法具有较高的准确度和精密度，系统误差小，测定结果比较准确，分析方法可行性高。

表2 加标回收率试验结果（n=6）

2.5 实际样品的检测

按照上述方法对含纳他霉素糕点和含有富马酸二甲酯的糕点质控样进行检测，并与国家标准方法进行比较，结果见表3。质控样的测试结果采用“z-比分数”评价，经分析，|Z|≤2，测试结果满意。结果表明，本方法的结果准确、可靠，适用于糕点中富马酸二甲酯和纳他霉素的同时测定。

表3 实际样品的检测

3 结论

本文建立了一种以高效液相色谱同时测定糕点中的富马酸二甲酯和纳他霉素含量的分析方法，对样品加入不同水平的储备溶液，经75%甲醇超声处理后，在优化后的高效液相色谱条件下进行上机分析，结果表明，富马酸二甲酯和纳他霉素均线性良好，且回收率和相对标准偏差也符合分析方法的要求。该法具有样品简单处理、测试快速简便、准确等优点，适用于大批量样品的快速测定。