一株西瓜细菌性果斑病生防菌的筛选、鉴定及其培养基优化

王雪妍，马 焕，岳丹丹，张志龙，李冠杰，张英涛

（河南省科学院生物研究所有限责任公司 郑州 450008）

瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是危害葫芦科作物的重要病害之一，也是一类毁灭性细菌病害，其病原菌为西瓜噬酸菌（）。病原菌最初被命名为类产碱假单胞菌西瓜 亚 种（subsp.），1992 年Willems 等将其更名为燕麦噬酸菌西瓜亚种（subsp.），2008 年更名为西瓜噬酸菌（）。细菌性果斑病最早于1969 年美国佛罗里达州被发现，随后在澳大利亚、日本、巴西、土耳其、希腊等国家均有发生的报道。目前，该病害在我国的河南、内蒙古、山东、陕西、甘肃、新疆、海南、广西等地区均有报道，给西瓜、甜瓜产业带来了严重威胁，造成了巨大的经济损失。

瓜类细菌性果斑病属于种传病害，其病原菌可以在种子中长期存活，具有较强的抗逆能力，给防治带来了极大的困难。目前，细菌性果斑病的防治主要集中在种子检疫、抗病品种选育、化学防治和生物防治等方面。在种子生产上应强化种子的消毒处理，确保种子无菌，应杜绝带菌种子进口。另外，使用抗病品种是防治细菌性果斑病的有效措施，但迄今为止，尚未发现对该病完全免疫或高抗的品种。细菌性果斑病的化学防治通常以药剂防治为主，但实际应用中很难做到科学合理地使用杀菌剂，化学药剂的大量使用不仅会造成环境污染，导致农药残留，而且会使病原菌逐渐产生抗药性。与化学防治相比，生物防治具有安全、无污染、对环境友好的优点，是绿色植保的重要内容，日益受到人们的青睐。因此，生物防治已成为植物病害防治的重要内容之一。目前，针对西瓜细菌性果斑病，国内外已报道的生防菌株有荧光假单胞菌（A506）、非 致 病 菌subsp.（AAA99-2）、荧光假单胞菌（）工程菌株（染色体整合了2，4-二乙酰基间苯三酚）、酵母菌（），以及芽孢杆菌如解淀粉芽孢杆菌（）、枯草芽孢杆菌（）等。笔者通过对西瓜根际土壤细菌的分离筛选，得到了一株对细菌性果斑病病原菌具有较好拮抗效果的生防菌株HP-24，通过形态学、生理生化试验和分子生物学手段对其进行了鉴定，并对其发酵培养基进行了优化，以期为生防菌剂的开发利用提供菌株资源，为细菌性果斑病的防治提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

土样采自河南省周口市太康县西瓜种植田。病原菌（燕麦噬酸菌西瓜亚种）来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为ACCC05732。培养基为营养肉汤培养基（NB 培养基），培养温度为28 ℃。

盆栽试验西瓜品种为早佳8424，种子购自北京万丰农研科技有限公司。NB 培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 值7.3；NA 培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，琼脂18.0 g，pH 值7.3；KB培养基：蛋白胨20.0 g，甘油10 mL，KHPO1.5 g，MgSO7 mL，HO 1.5 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 值7.2。

1.2 方法

1.2.1 土样采集和生防菌初筛 根据种植西瓜品种不同，从瓜田植株根附近分别采集土壤样品（采集时间为2020 年8 月9 日），西瓜品种分别为早佳8424、黑美人和美都。2020 年8 月在实验室各取土样10 g 加入到装有90 mL ddHO 和10 个玻璃珠（已灭菌）的三角瓶中，180 r·min振荡30 min，充分打散土样，制成土壤悬浮液，用10 倍梯度稀释法依次稀释至10，再分别从稀释倍数为10、10、10的稀释液中取100 μL 涂布干NA 平板上，每个稀释浓度3 次重复，30 ℃恒温培养24 h 后挑取具有明显差异的菌落，经平板划线纯化，编号后保存备用。

1.2.2 生防菌的复筛 将病原菌在NB 培养基中活化后制成浓度为10CFU·mL的菌悬液，吸取2 mL于KB 平板上，轻轻晃动平板，使菌液布满整个平板，随后将多余的菌液吸出，于生物安全柜的无菌环境中风干培养基平板表面的菌液。将筛选出的生防菌均匀点种到平板上，每个菌株重复点接3次，28 ℃培养48 h，筛选出具有抑菌圈的菌株。将有拮抗作用的菌株进行多次继代培养，选择拮抗作用稳定且效果最好的菌株。

1.2.3 盆栽防效的测定 采用盆栽西瓜幼苗喷雾法测定菌株HP-24 的防治效果。选取健康、饱满的西瓜种子进行催芽处理，然后采用常规方法播种于盆钵内（口径13 cm×18 cm），试验在河南省科学院生物研究所人工环境气候箱中进行。待西瓜幼苗长出2～3 片真叶后（2022 年5 月16 日），将活化好的菌液浓度为10CFU·mL的HP-24 菌悬液喷施到真叶上，晾干后采用喷雾法接种菌液浓度为10CFU·mL的西瓜细菌性果斑病病原菌，叶片正、反两面要均匀喷施。30 ℃保湿24 h 后进行常规管理，以喷KB 液体培养基的处理为对照，观察发病情况。每个处理3 盆重复，每盆5 棵苗。7 d 后，观察西瓜幼苗的发病情况，计算病叶率、病情指数及防治效果。

1.2.4 生防菌株的鉴定 形态学观察及生理生化鉴定：将拮抗作用最好的菌株HP-24 接种于NA培养基上，30 ℃培养24 h 后，观察菌落和菌体形态，并参照《常见细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定试验。

16S rRNA 基因序列分析：提取菌株的基因组DNA，采用通用引物27F/1492R 进行PCR 扩增，引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR 扩增体系为25.0 μL，包括ddHO 18.0 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，正向和反向引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，DNA 聚合酶0.5 μL。PCR 反应条件为95 ℃4 min，95 ℃1 min，52 ℃30 s，72 ℃2 min，30 个循环；72 ℃10 min。PCR 扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后测序，测序结果在GenBank 数据库中进行BLAST 相似性比对。

系统发育树构建：测序获得的16S rRNA 部分序列经BLAST 同源比对后，从GenBank 中获取同源性较高的相邻的种、属的序列，同时查找相邻种、属中模式种的16S rRNA 序列，使用MEGA 6 软件进行系统发育树构建。

1.2.5 有菌与无菌发酵液的抑菌试验 将菌株HP-24 接种到100 mL NB 液体培养基中，30 ℃180 r·min培养24 h，发酵液于4 ℃10 000 r·min离心20 min，再用孔径为0.22 μm 的细菌过滤器过滤上清液，得到无菌发酵液。在涂布病原菌液的KB 平板上用无菌打孔器打孔，向孔内加入带菌发酵液和无菌发酵液各50 μL 及离心得到的菌体，于30 ℃培养48 h，每个处理3 次重复，观察抑菌效果。

1.2.6 不同浓度发酵液的抑菌试验 将菌株HP-24

接种到100 mL NB 液体培养基中，30 ℃180 r·min培养24 h 后，用无菌的NB 培养基分别稀释2、4、8倍。在涂好病原菌液的KB 平板上用无菌打孔器打孔，分别向孔内加入不同稀释倍数的发酵液各50 μL，于30 ℃培养48 h，每个处理3 次重复，观察抑菌效果。

1.2.7 发酵培养基的优化 碳源的优化：于250 mL三角瓶中配置100 mL 培养基，其中蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g，分别选取牛肉膏、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源，碳源添加量为0.3 g，调节pH 值为7.3，接入种子液2 mL，30 ℃180 r·min培养24 h，每个处理3 次重复，根据活菌数确定最佳碳源。配置不同浓度的碳源培养基，其中蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g，碳源为经优化确定的最佳碳源，质量分数分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%，调节pH 值为7.3，接种量为2%，30 ℃180 r·min培养24 h，每个处理3 次重复，统计活菌数并确定最适碳源浓度。

氮源的优化：于250 mL 三角瓶中配置100 mL培养基，其中牛肉膏0.3 g、氯化钠0.5 g，分别选取蛋白胨、酵母粉、蛋白胨+酵母粉、尿素、麸皮、硫酸铵作为氮源，氮源的添加量为1.0 g，调节pH 值为7.3，接入种子液2 mL，30 ℃180 r·min培养24 h，每个处理3 次重复，根据活菌数确定最佳氮源。配置不同浓度的氮源培养基，其中牛肉膏0.3 g、氯化钠0.5 g，氮源为经优化确定的最佳氮源，质量分数分别为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%，调节pH值为7.3，接种量为2%，30 ℃180 r·min培养24 h，每个处理3 次重复，统计活菌数并确定最适氮源浓度。

无机盐的优化：于250 mL 三角瓶中配置100 mL 培养基，其中牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g，分别选取氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾作为无机盐，无机盐的添加量为0.5 g，调节pH 值为7.3，接入种子液2 mL，30 ℃180 r·min培养24 h，每个处理3 次重复，根据活菌数确定最佳无机盐种类。配置不同浓度的无机盐培养基，其中牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g，无机盐为经优化确定的最佳无机盐，质量分数分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%，调节pH 值为7.3，接种量为2%，30 ℃180 r·min培养24 h，每个处理3 次重复，统计活菌数并确定最适无机盐浓度。

正交试验：根据单因素试验结果，分别选择牛肉膏、麸皮和氯化钾作为发酵培养基的碳源、氮源和无机盐，以其在单因素试验中确定的浓度为标准，分别设定3 个不同的浓度，用3 因素3 水平的正交试验优化培养基的主要成分，得到最佳的培养基组成成分。

1.3 数据处理

试验结果采用Excel 2010 和SPSS 19.0 软件进行统计分析，采用LSD 法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌的筛选

从周口市太康县种植西瓜的土壤中采用稀释涂板法分离纯化得到82 个菌株，通过平板对峙法筛选获得对西瓜果斑病病原菌有拮抗作用的16 个菌株。对这16 个菌株采用抑菌圈法测定抑菌效果，结果如表1 所示，菌株HP-24 的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到2.40 cm（图1）。显著高于其他菌株的抑菌圈直径。

表1 菌株抑菌圈大小

图1 菌株HP-24 对西瓜果斑病病原菌的抑菌圈

2.2 盆栽防效的测定

盆栽试验结果（表2）表明，菌株HP-24 对西瓜细菌性果斑病具有较好的防治效果。在接种细菌性果斑病病原菌后7 d，对照组的病情指数为62.03，而菌株HP-24 处理的西瓜苗病情指数为14.44，与对照组相比，发病率显著降低了73.01%，其防治效果达76.72%。

表2 菌株HP-24 对西瓜细菌性果斑病的防治效果

2.3 生防菌的鉴定

如图2 所示，HP-24 菌株的菌落呈白色，近圆形，表面突起有褶皱，不透明，在显微镜下观察呈杆状，产芽孢，芽孢卵圆形。革兰氏染色为阳性，生理生化特性为接触酶阳性，明胶水解阳性，淀粉水解阳性，卵磷脂酶反应阴性，甲基红试验阴性，VP 试验反应阳性，柠檬酸盐利用为阳性。

图2 菌株HP-24 菌落形态

将HP-24 的16S rRNA 序列通过BLAST 软件进行同源性比较，选取同源性较高的参考菌株16S rRNA 序列，通过MEGA6 软件构建系统进化树。菌株HP-24 为芽孢杆菌属，且与贝莱斯芽孢杆菌（）亲缘关系较近（图3）。

图3 根据HP-24 菌株16S rRNA 序列构建的系统发育进化树

2.4 有菌与无菌发酵液抑菌效果测定

不同的发酵液对病原菌的抑制效果如图4 所示，有菌发酵液及菌体对病原菌有抑制作用，而无菌发酵液对病原菌无抑制作用。

图4 有菌发酵液、无菌发酵液及菌体对病原菌的抑制作用

2.5 不同浓度发酵液的抑菌效果测定

菌株HP-24 的不同浓度菌液对病原菌的抑制作用如表3 所示，结果表明高浓度的发酵液抑菌效果最好，随着稀释倍数的增加，抑菌圈直径逐渐变小，说明发酵液菌液浓度越高，抑菌效果越好。

表3 不同浓度发酵液抑菌圈的大小

2.6 培养基的优化

2.6.1 碳源的优化 如图5 所示，当牛肉膏为唯一碳源时，菌株生长最好，培养24 h 后活菌数最高，且显著高于其他碳源条件下的活菌数，即最适碳源为牛肉膏。图6 为当牛肉膏为唯一碳源时，不同浓度的牛肉膏对菌株生长的影响。结果显示，不同浓度的碳源对菌株生长影响差异显著，当牛肉膏的质量分数为0.9%时，发酵液中菌落数显著高于其他浓度牛肉膏中的菌落数，即最适碳源为0.9%的牛肉膏。

图5 不同碳源对菌株生长的影响

图6 牛肉膏浓度对菌株生长的影响

2.6.2 氮源的优化 如图7 所示，当氮源为麸皮时，发酵液中活菌数最高，且显著高于其他氮源条件下的菌落数。其次是蛋白胨和酵母粉的混合物，蛋白胨和酵母粉的混合物作为氮源时，效果较单一的蛋白胨或酵母粉要好。当氮源为尿素时，菌株发酵液中活菌数最低，即最佳氮源为麸皮。图8 为麸皮为唯一氮源时，不同浓度的麸皮对菌株生长的影响。由图8 可以看出，在供试浓度范围内，当麸皮的质量分数为1.2%时，发酵液中的活菌数显著高于其他麸皮浓度，当浓度偏高或偏低时均不利于菌株的生长，即最适氮源为1.2%的麸皮。

图7 不同氮源对菌株生长的影响

图8 麸皮浓度对菌株生长的影响

2.6.3 无机盐的优化 无机盐优化结果如图9 所示，当无机盐为氯化钾时，菌株发酵液中的活菌数最高，且与无机盐为氯化钠、磷酸二氢钾相比活菌数差异显著，即最佳无机盐为氯化钾。图10 为当氯化钾为唯一无机盐时，不同浓度的氯化钾对菌株生长的影响。当氯化钾的质量分数为0.7%时，菌株发酵液中活菌数显著高于其他氯化钾浓度，即最适无机盐为0.7%的氯化钾。

图9 不同无机盐对菌株生长的影响

图10 氯化钾浓度对菌株生长的影响

2.6.4 正交试验结果 根据单因素试验结果选择最佳碳源、氮源及无机盐，对影响发酵液菌落数的最适碳源、氮源及无机盐各因素按不同浓度进行正交试验（表4），用3 因素3 水平的正交试验优化培养基的主要成分，得到最佳培养基组成。

表4 L9（3×3）正交试验因素水平

根据正交试验结果比较3 种因素的R 值可知B>A>C（表5），因此，影响发酵液菌落数多少的主次因素依次为麸皮浓度>牛肉膏浓度>氯化钾浓度。为确定各因素对试验结果的影响，对正交试验进行方差分析。结果如表6 所示，牛肉膏、麸皮浓度对发酵液菌落数的影响显著，氯化钾浓度对菌落数影响不显著。根据正交试验结果得出的最优培养基组成为A3B3C2，即牛肉膏1.0%，麸皮1.3%，氯化钾0.7%。

表5 正交试验结果

表6 正交试验结果方差分析

2.6.5 正交试验结果验证 当培养基组成为牛肉膏1.0%、麸皮1.3%、氯化钾0.7%时，在30 ℃180 r·min条件下，培养24 h 后测菌落数为1.17×10CFU·mL。

3 讨论与结论

在现代农业生产过程中，随着环境污染、农药残留以及抗药性等问题的产生，生物防治技术在农业病虫害防治中的应用越来越受到青睐。目前，许多有益微生物已应用于植物病害的生物防治中，而植物根际中的微生物在植物的生长发育和抵御病害的过程中起着重要重用，具有巨大的开发价值。国内外关于植物根际微生物防治植物病害的报道很多。芽孢杆菌在自然界中广泛存在，是植物病害生物防治中应用较为普遍的生防细菌。其中贝莱斯芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一个新种，与枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌亲缘关系密切，目前已有利用贝莱斯芽孢杆菌防治花生白绢病、棉花枯萎病、辣椒疫霉病、西瓜枯萎病等多种植物病害的报道。然而，未见有利用贝莱斯芽孢杆菌防治细菌性果斑病的报道。本试验筛选到一株对西瓜细菌性果斑病致病菌具有抑制作用的贝莱斯芽孢杆菌HP-24，为细菌性果斑病的生物防治提供了新的菌种资源。芽胞杆菌的防病机制一般包括代谢产物含抗菌物质、寄生于病原菌与之竞争营养和空间、诱导植物产生系统抗病性等。谢心悦等研究发现解淀粉芽孢杆菌BJ-10 的无菌发酵液稀释5 倍后对甜瓜细菌性果斑病的防效仍能达到87.5%。而笔者研究发现贝莱斯芽孢杆菌HP-24 的无菌发酵液对细菌性果斑病病原菌无抑制作用，菌株HP-24 所产生的抑菌物质可能为胞内代谢产物；此外，生防菌与病原菌之间进行营养和空间的竞争，也会导致对病原菌的抑制作用，产生抑菌圈，具体的抑制机制有待进一步研究。

笔者结合平板对峙试验和盆栽试验，筛选到西瓜细菌性果斑病的拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌HP-24。该菌对西瓜细菌性果斑病病原菌的抑菌圈直径可达到2.40 cm，盆栽防效为76.72%，可作为西瓜细菌性果斑病的生物防治菌株。另对生防菌株HP-24 的培养基进行优化，得到菌株最优培养基组成为牛肉膏1.0%、麸皮1.3%、氯化钾0.7%，优化后的菌株HP-24 培养基组成可显著提高发酵液中的活菌数量，为后期生防菌的工业化生产提供了参考。

综上所述，贝莱斯芽孢杆菌HP-24 在防治西瓜细菌性果斑病方面具有极大的潜力，可以为细菌性果斑病的防治提供菌株资源。同时，发酵培养基的优化也为生防菌剂的后续开发提供了技术支撑。