我国瓜类细菌性果斑病研究新进展

季苇芹，叶云峰，张爱萍，杨玉文，关 巍，赵廷昌

（1.中国农业科学院植物保护研究所·植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100193； 2.广西壮族自治区农业科学院园艺研究所 南宁 530007； 3.新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所 新疆五家渠 831300）

瓜类细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）是一种主要危害西瓜和甜瓜的毁灭性细菌病害，于20 世纪末传入我国，最早报道于陕西省，随后在许多省份相继报道。目前，BFB 在我国的新疆、海南、内蒙古、辽宁、吉林等10 余个省份均有发生，造成严重的经济损失，仅海南每年的损失就达5 亿元（2021 年西甜瓜产业联盟大会报告）。由于BFB 发病快、传播迅速，而且缺乏有效的抗病品种和针对性防治药剂，因此使其在生产上难防难治，严重阻碍了西瓜、甜瓜产业的可持续发展。BFB 已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录及全国农业植物检疫性有害生物名单。

近年来，国内外对BFB 开展了大量的研究，国内5 年以前的研究进展已有研究者进行了相关综述，因此笔者整理归纳了近5 年我国对BFB 的研究新进展，以期为制定瓜类细菌性果斑病综合防治策略提供参考，并为今后研究工作的开展提供思路和方向。

1 病原、症状及发病规律

1.1 病原菌及其寄主范围

细菌性果斑病的病原菌为西瓜噬酸菌（），属于革兰氏阴性菌。西瓜噬酸菌主要危害葫芦科作物，对西瓜、甜瓜、苦瓜的致病力极强，侵染率可达到100%；对南瓜、西葫芦、丝瓜、黄瓜的致病力也较强，但病斑扩展速度不同；对番茄、白菜、辣椒、豇豆不致病。种内主要分为2个亚组，不同组菌株在基因组水平上存在差异，在寄主范围上也表现出明显的偏好性，Ⅱ组菌株主要分离自西瓜，而Ⅰ组菌株主要分离自除西瓜外的其他葫芦科作物，如甜瓜、黄瓜、葫芦、瓠瓜等。

1.2 病害症状

瓜类细菌性果斑病可在作物的整个生长发育期发生。子叶受害时，初期形成水渍状病斑，随后扩延至子叶基部，严重时会沿叶脉发展成黑褐色坏死病斑。真叶受害时，叶片出现水渍状斑点，病斑受叶脉限制而呈现多种形状，病斑周围略微发黄，但无明显凹陷和晕圈，多个病斑可融合成大斑且变褐色，严重时整个植株枯萎，但叶片不脱落；茎部受害时，常形成凹陷斑，并能分泌菌脓，导致瓜蔓腐烂；果实上的典型病症是向阳面果皮上出现水浸状小斑点，逐渐扩大为不规则的水浸状斑块，渐变褐，稍凹陷，后期多龟裂，随着病原菌向果肉扩展，果肉呈水浸状腐烂或棉絮状坏死，流出黏稠的臭味菌脓，随流水飞溅，可造成二次侵染（图1）。

图1 瓜类细菌性果斑病在西瓜及甜瓜上的危害症状

1.3 发病规律

种子带菌是BFB 的主要初始侵染源。病菌可附着在种子表面，随种子的萌发从伤口或气孔侵染子叶，引起幼苗发病，并随雨水、灌溉水、昆虫及农事操作传播扩散，形成多次再侵染。发病瓜是带菌种子的重要来源，附着在种子或土壤病残体上越冬的病原菌在来年再次引起侵染，进而形成恶性循环。此外，受BFB 污染的葫芦科砧木种子也是引起BFB 传播的重要传染源。

BFB 在高温高湿的环境中易暴发流行，特别是炎热季节伴随暴风雨的条件，有利于病原菌的繁殖和传播。BFB 最适发病温度为25～32 ℃，在24～28 ℃条件下接种1 h 后就能侵入叶片。另外，地势低洼、排水不良、多年连作、密度过大、管理粗放的地块发病严重。

1.4 病原菌鉴定方法

近年来，主要通过病害症状观察、菌落形态观察、生理生化特性测定、病原菌血清学鉴定、16S rRNA/rDNA 测定、特异性引物鉴定、烟草过敏反应测定、致病性测定、亚群鉴定等方法，对BFB 病原菌进行鉴定。利用这些方法能够准确、便捷地鉴定出病原菌是否为，以及所属亚组，为生产上对该病的识别及针对性治理提供重要依据。

2 致病机制

研究的致病机制是了解病原-寄主互作过程、研发靶向药剂及制定环境友好型高效防治策略的重要基础。近年来，对致病机制的研究主要集中在三型分泌系统（type Ⅲsecretion system，T3SS）、六型分泌系统（type Ⅵsecretion system，T6SS）、鞭毛、生物膜、调控因子、群体感应系统和细胞代谢过程等方面。

T3SS 广泛存在于革兰氏阴性菌中，在病原菌致病过程中至关重要。毛云等利用生物信息学，分析了3 个三型（hypersensitive response and pathogenicity）蛋白和6 个未知蛋白的理化性质和二级结构，为后续对这些蛋白的研究奠定了基础。在基因功能方面，T3SS 分泌装置基因、结构基因和（-associated）基因及的缺失会显著减弱致病力并影响致病相关表型。在调控方面，Zhang 等发现基因和是T3SS 的关键调控基因，调控下游基因的表达，且在上游正向调控的表达。在三型效应蛋白（T3Es）的筛选与鉴定方面，目前筛选到的T3Es 有Ace1、Ace0201、AopN 和AopP。其中，Ace1 和Ace0201 均可抑制本氏烟的细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）及活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发，促进对寄主西瓜发挥致病作用。AopN 能显著抑制ROS 爆发并诱导细胞程序性死亡，与西瓜的Cl-HIPP 和ClLTP 蛋白互作；AopP 可通过抑制蛋白ClWRKY6 来抑制西瓜的免疫反应。随着研究的深入，针对T3SS 抑制剂的研发将为BFB 精准防治开辟道路。

T6SS 影响细菌间的相互竞争，也是导致病原菌产生毒力的原因之一。基因是T6SS 的重要组成部分，也是T6SS 介导毒力作用的关键因子。研究表明，的3 个基因（//）和4 个同 源 基 因（///）在T6SS 介导的病原菌毒力作用中发挥重要作用，影响毒力和抗菌活性。

鞭毛是病原菌的重要运动器官，鞭毛可促进病原菌对寄主细胞的黏附与侵袭，在致病过程中起重要作用。研究表明，鞭毛基因、及鞭毛转录调控因子对鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、黏附能力、生长速率、致病性等具有调控作用。同时，研究鞭毛基因和趋化性核心基因时发现，趋化性核心基因通过调控鞭毛运动影响的运动能力。

细菌生物膜与其致病性密切相关。研究发现环境因素可以影响生物膜的形成，以LB（牛肉膏蛋白胨培养基）为培养基、聚苯乙烯孔板为载体，初始pH 值为7、培养温度28 ℃、培养时间24 h、葡萄糖浓度为30.0 mmol·L时，的生物膜形成能力最强。

脂多糖运输系统（lipopolysaccharide transport system，Lpt）将胞内装配完整的脂多糖运输到外膜，实现脂多糖的阻渗、有机溶剂和疏水性抗生素耐受性、膜通透性等功能。基因簇编码的Bam 复合体为Lpt 的重要组成，基因和缺失降低了的生物膜形成能力和胞外多糖产生能力，使蛋白酶活性增强，从而直接影响细胞外膜合成。

调控因子作为调控枢纽，调控病原菌的生长、致病等多项生命活动，保障病原菌的生存、生长和繁殖，是解析病原菌致病过程不可缺少的研究对象。研究发现，γ-谷氨酰转移酶编码基因在致病过程中具有重要作用；环境应激调控因子和血红素氧化酶（heme oxygenase）基因缺失可显著减弱的生长、运动和致病能力；红光受体蛋白和缺失可减弱在光照条件下的生长和致病能力，中的GTP 结合蛋白HflX 可通过调控等T3SS 关键基因参与对寄主的定殖和侵染。MarR 家族转录因子可能通过调控的表达及生物膜形成来影响的致病能力。这些调控因子虽然功能各不相同，但都不同程度地参与了调控的致病过程。

群体感应系统是病原菌为应对外界环境变化对自身进行的调控，与病原菌的生长发育和致病过程密切相关。研究发现，群体感应系统中LuxR 家族转录因子AryR 和AclR 对的运动性、致病力、生物膜形成以及生长能力都有影响，而转录因子AcrR 能特异性地调控鞭毛的形成，在生长模式调节中具有重要作用。环二鸟苷酸（cyclic diguanylate,c-di-GMP）代谢是群体感应过程中重要的信号传递系统，研究发现c-di-GMP 代谢相关基因缺失可显著降低致病力、生物膜形成能力和生长能力，减弱运动能力及在非寄主烟草上的过敏性反应能力。

铁代谢和铜代谢都是病原菌中的重要代谢过程，铁/铜代谢紊乱不利于病原菌的生存，是研制靶向防治药剂的重要靶标。研究表明，中铁吸收调控因子（ferric uptake regulator,Fur）缺失后，显著降低产铁载体能力、致病力以及对Fe和HO的耐受能力，使铁离子调控机制紊乱。中可能存在与大肠杆菌（）等相似的铜离子外排系统（Cue 系统），且转录调控因子和铜代谢相关基因缺失均显著降低抗铜能力，是铜代谢过程中重要的功能基因。

在病原-寄主互作过程方面，张艳艳等发现不同亚组的西瓜噬酸菌菌株侵染相同寄主时引起的植物感病途径不同。优丽图孜·乃比等对西瓜噬酸菌-黄瓜互作体系进行转录组分析发现，接种48 h 后，中致病相关基因显著富集在群体感应及细菌趋化性途径，且群体感应系统基因下调更显著。寄主黄瓜以Ca信号激活的防御反应为主应对侵染，苯丙氨酸裂解酶基因和谷胱甘肽S-转移酶基因在此过程中发挥重要作用。

此外，黄成文等发现载体pBBR1MCS-5 对菌株FC440 的生物学特性未表现出显著影响，而载体pHC60 则会影响FC440 的生长速率及游动能力。这为遗传改良过程中选择合适的表达载体提供了重要基础。

3 防治技术

近年我国对BFB 防治技术的研究主要集中在检疫检测、化学药剂防治、生物防治、抗病育种以及农业管理措施等方面。

3.1 检疫检测

BFB 可通过带菌种子、幼苗进行远距离传播，植物检疫是BFB 防控的第一道防线。针对我国BFB 防控形势，应推进疫情分区防控，加强种子及砧木检疫监管，强化监测预警，建立联防联控工作机制。

Tian 等于2010—2018 年间检测了我国13 个主产区的4839 份商品西瓜和其他瓜类种苗携带的情况，发现样本总体带菌率为18.00%。不同年份样本带菌率在6.71%～40.76%之间。种子检测是预防果斑病发生的首要环节，因此建立快速、简便、灵敏的带菌种子检测方法非常重要。

当前国内对带菌种子的检测主要有PCR、血清学检测、试纸条等方法。Yang 等根据基因设计了引物BFB/BFB1/BFB2/BFB3，可通过普通PCR区分不同亚组菌株。Bi 等利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实现与CGMMV等病原的多重检测。闫莉春根据基因设计了特异性引物AC-F/AC-R，可区分和其他近缘种燕麦噬酸菌等，灵敏度为10CFU·mL。阚玉敏等利用Bio-PCR 筛选出对特异性最好的引物SEQID4m/SEQID5。李菊芬等认为带菌种子用无菌水振荡培养3 h 后进行PCR 扩增，操作简单且特异性最好，建议普通PCR 选用BX-L1/BX-SR2 引物，RT-qPCR 选用SEQID4m/SEQID5 引物。将RT-qPCR 应用于微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测，可提高检测灵敏度。赵子婧等应用ddPCR 建立了同时检测瓜类种子携带和黄瓜角斑病菌（pv.）的方法，混合菌悬液和DNA 的最低检出限分别为10CFU·mL和10ng·μL，可检测到带菌率0.2%（=500）的西瓜、甜瓜种子样品，优于RT-qPCR 法。

血清学检测也是常用的BFB 检测方法。Kuo等利用改造的绿色荧光蛋白GfED 与IGg 的结合开发出一种血清学检测法，操作简单，速度快，结果肉眼可见。

在实际检测中，试纸条由于操作简便、耗时短，不需设备和复杂程序，可实现BFB 的快速检测和初步筛选。Zeng 等开发的异硫氰酸荧光素免疫试纸条，可快速、灵敏地检测。薛娟娟建立了一种检测限为1×10CFU·mL的免疫层析分析（ICA）检测法，与黄瓜细菌性角斑病菌无交叉反应，特异性较好。Fang 等开发的免疫层析荧光试纸条可在和等的杂交细胞中检测到，结果准确而用时短。曾海娟等制备了一种检出限为3.1×10CFU·mL的检测荧光免疫层析试纸条，提供了新的快速检测方法。周佩等发现中国检验检疫科学研究院研制的BFB 胶体金检测试纸条和市场上已商品化但价格较贵的美国Agdia 公司的同类试纸条的灵敏度和特异性相当，适用于检测出现疑似果斑病症状的叶片和果实，也可用于种子带菌检测，但易受种子包衣剂或处理药剂的影响，出现假阳性结果。

由于不适的温度条件（如温汤浸种或低温储存）和药剂（如铜离子制剂）处理可诱导进入VBNC 状态（有活力但不可培养状态），建议运用多种检测方法进行种子带菌检测和病害诊断，避免由菌量低或进入VBNC 状态导致的假阴性结果。

3.2 种子处理

种子处理是预防BFB 的有效措施。对种子进行适宜温度及时间的干热处理（如60 ℃处理甜瓜种子6、8 d 及60 ℃处理西瓜种子12 d）或温汤浸种，可显著抑制带菌种子和幼苗的发病率；控制发酵温度不能减少对种子感染，减少发酵时间才是减少病菌增殖感染种子的防控关键。此外，西瓜汁发酵可能不是有效降低传播的方法。

用盐酸、过氧乙酸等药剂，特别是杀菌剂1 号处理种子，对BFB 均有很好的防治效果。杨奎等发现包衣成分BF 配方肥+硫酸铜对BFB 有良好防效，且可促进幼苗生长。

3.3 化学防治和生物防治

化学防治是现阶段BFB 防治的主要手段。不同杀菌剂对的毒力差异较大，同一杀菌剂在离体和活体试验中的结果也不同。在发病前或发病初期，可选用适宜浓度的双氧水、苏纳米、过氧乙酸、BX6、四霉素、乙蒜素、氢氧化铜、氧化亚铜、溴硝醇、春雷·王铜、噻霉酮等药剂进行喷雾防治，但要注意用量，避免药害。比较幼苗发病前预防和发病后防治的效果发现，提前预防能较好地控制病害。

生物防治方面，目前毕赤酵母菌（）0732-1 代谢产物乙酸、枯草芽孢杆菌（）9407、皱纹假单胞菌（）S58、荧光假单胞菌（）和溶磷伯克氏菌（sp.）N3等对有良好防效。

3.4 抗病育种

选育抗性品种是防控BFB 最经济、有效的途径。近年来，国内不断挖掘抗性基因和筛选抗性材料，为抗病品种的选育奠定了基础。

在抗性基因挖掘方面，葛宗灿等发现基因Ⅰ不是无毒基因，不能起到作用；俞志杰等在甜瓜上筛选出1 对与抗性基因连锁的标记BCM184，遗传距离为12.4 cM，初步定位到连锁群Ⅳ上；鲁思梦等在甜瓜上筛选出1 个BFB 抗性数量性状位点，位于CMMS35-4 与DE1851 之间，为后续利用抗性品种进行品种改良提供了理论依据。

在抗性材料筛选方面，刘梦华等将菌株LG08 接种到50 份甜瓜材料上，发现薄皮甜瓜系列和玉菇类型对有相对较强的抗性，哈密瓜类型易感病。罗群等将菌株XS0901 接种到50 份瓠瓜材料上，发现没有对BFB高抗或免疫的瓠瓜品种，且市场商品性最优的匀棒瓠瓜（608）和其他江浙主栽品种对BFB 的抗性较差，瓠瓜新品种浙蒲9 号对BFB 表现中抗。

3.5 农业管理措施

科学合理的农业管理措施是BFB 防治的重要手段，主要包括：选择3 年内无病的通风良好、排灌方便的砂性壤土；在露水干后进行农事操作，工具、操作人衣物和手部需消毒；起垄栽培，使用滴灌，严禁大水漫灌，果实膨大期及成瓜后少浇或不浇水；及时通风排湿；及时将病株带出棚外深埋作无害化处理；合理施肥，不偏施氮肥；与非葫芦科作物进行3 年以上轮作，或水旱轮作倒茬。洪纤纤等在与西瓜套种的甘薯上分离出了，因此套种非寄主作物有可能无法隔绝BFB 在西瓜植株间的传播。

4 展 望

近年来，由于生产上对BFB 高效防治的迫切需求，科研工作者对BFB 开展了大量研究，并取得了很大进展。在病原菌鉴定与检测方面，技术和设备的飞速发展，使病原鉴定和检测实现操作方便、结果即测即得和可视化，为生产上BFB 的快速检测奠定了坚实基础。在致病机制方面，通过对病原菌分泌系统、群体感应、毒力因子、细胞代谢的研究，以及对病原-寄主互作过程的研究，初步解析了的致病机制，但具体的致病机制尚未明确，还有许多问题尚待研究解决。

在病害防控方面，研究主要集中在种子处理、种苗保护、病苗治疗及抗性材料选育等方面。目前生产上多以化学药剂防治措施为主，缺乏针对性，存在药物过量使用甚至滥用的问题，加重了环境负担以及导致病原菌抗药性增强的风险。在研究过程中，虽然筛选了许多有效的化学药剂和一些防效较好的生防菌株，但是环境友好型药剂研制、病原菌抗药性以及生防菌株对环境的适应性和效果稳定性等仍是未来亟需攻克的难题。由于BFB 为种传病害，随着种苗商品化的发展，病原菌流动性风险增强。因此，加强种子和幼苗的检疫检验、阻断带菌种子的流通能有效阻断BFB 的跨地区传播；加强农田管理，采用科学的综合防控措施，可有效降低BFB 在田间的传播。

总之，为实现BFB 的高效防治，仍需进一步开展致病机制的研究以及商品化抗性品种选育等工作。