翻耕扰动下喀斯特耕地N2O排放规律及影响因素

肖霜霜，叶莹莹，陈武荣，肖丹，毛兵，张伟*，王克林

（1.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125；2.南宁师范大学广西地表过程与智能模拟重点实验室，广西 南宁 530000；3. 南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室，广西 南宁 530000；4. 湖南农业大学资源环境学院，湖南 长沙 410128）

氧化亚氮（N2O）是一种主要的温室气体，全球每年向大气排放约16至20 Tg/a，其中，农业占人为N2O排放量的67%~80%[1]，大约50%的人为N2O排放源于耕地[2]。然而，以往研究表明翻耕扰动对土壤N2O排放的影响存在争议。有人认为传统翻耕措施减少了N2O排放[3-4]，也有研究表明翻耕显著增加N2O排放量[5-6]或无显著影响[7]。造成这些研究结果不一致的原因主要是翻耕扰动引起土壤性质发生变化，如土壤水分温度[8-9]、物理结构[10-11]、基质[12-13]及微生物等[14-15]，最终导致土壤N2O排放规律不同。因此，翻耕措施对土壤N2O排放的影响可能会由于翻耕强度、土壤性质或当地气候条件等影响而变化各异，各地区农业活动产生的N2O排放规律及主要影响因子具有较大不确定性，因此仍需进一步研究。

我国是世界上喀斯特面积最大、分布最广的国家，主要集中在西南区域，具有土壤浅薄、土被不连续、土壤pH值高和生态系统脆弱等特征[16]。以往研究表明喀斯特地区土壤总氮高于同纬度非喀斯特地区[17]，但在人为干扰下氮素迅速丢失，尤其是开垦两年后，喀斯特土壤速效氮损失率高达38%[18]。在前期研究中，我们发现该地区开垦初期由翻耕扰动触发的全氮损失主要由5~8 mm大团聚体破碎造成[19]。土壤N2O排放是土壤氮素损失的重要途径之一。喀斯特地区耕作扰动导致总氮迅速损失的背景下，土壤N2O排放规律如何仍不清晰。因此，揭示翻耕扰动下喀斯特土壤N2O排放规律及其影响因子，是全面了解土壤氮素快速损失机理的重要部分。针对以上问题，我们基于中科院环江喀斯特野外试验站原位翻耕模拟小区，研究不同翻耕频率下土壤N2O的排放规律，并解析土壤团聚体、基质、温度及水分等土壤性质对N2O排放的影响，以期为喀斯特地区减少N2O排放，选择合理田间管理方式提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究试验区位于广西壮族自治区环江毛南族自治县中国科学院环江喀斯特生态系统观测研 究 站（24°43′58.9″~24°44′48.8″N，108°18′56.9″~108°19′58.4″E）。研究区位于典型喀斯特峰丛洼地地貌区，是云贵高原向广西丘陵过渡的九万大山坡麓地带，具有峰丛洼地地貌的特有特征。土壤为石灰土，具有高黏土和高钙特征，土壤质地为粘壤土，属于典型亚热带季风气候，日照数较长，平均约为1 451 h，年平均气温约为18.5 ℃，年平均降雨量约为1 380 mm，雨季主要发生在4月至9月，10月至次年3月气候相对干燥。1985年之后，由于研究区居民全部外迁，耕地全部撂荒，进入自然恢复状态[19]。

1.2 试验设计

结合前期调查，2013年底在中国科学院环江喀斯特生态系统观测研究站选取典型坡脚部位建立样地。试验区建设之前覆盖植被为灌木林，主要优势种为三对节（Clerodendrum serratum）、八角枫（Alangium chinense(Lour.)Harms）、千里光（Senecio scandens Buch.-Ham. ex D. Don.）等。喀斯特地区种植玉米主要为2季，保护性耕种时为免耕，传统种植时在播种前进行翻耕，中耕除草作为传统除草措施仍存在于当地田间管理。为了研究作为物理扰动的翻耕如何引起土壤理化性质变化进而影响N2O排放，我们在地上植被被移除后，采用完全随机区组设计，设置5种翻耕频率：1）T0为对照不翻耕处理；2）T1为每六个月翻耕一次；3）T2为每四个月翻耕一次；4）T3为每两个月翻耕一次；5）T4为每个月翻耕一次。每个处理为2 m ×2 m小区，均为4个重复。各微区四周由PVC板隔断，PVC板地下埋深为30 cm，以阻碍相邻小区土壤侧向的养分流动；地上出露20 cm，以阻断周围地表径流的流入。微区内安插模拟仿真植物代替农作物（玉米），简化试验影响因素，消除试验过程中作物根际分泌对土壤N2O排放的影响，从而更明确地研究翻耕措施对N2O排放的影响规律和机制（图1）。翻耕方式采用该地区普遍的手动翻耕，翻耕深度为0~15 cm。小区建立后经过6个月的稳定期，2014年7月开始施加处理，于每月第1天进行翻耕。

1.3 样品采集和处理

从2014年7月至2015年6月采集N2O气体样品。由于参考相关文献[20]及预实验，土壤N2O排放变化主要发生在施加翻耕处理后一周内，之后趋于稳定；且本翻耕模拟实验无施肥、灌溉及作物生长等因素影响。因此本研究在翻耕第一周每隔两天采集一次，翻耕当月月末采集一次，即第1、3、5、7和30 d。采样时间为上午9:00~10:00，该时间段内测定的土壤气体排放速率可代表日均排放速率[21]。采用静态箱气体收集装置采集，采样箱由箱盖和底座组成，箱盖是由PVC材料做成的圆柱体，尺寸为直径25 cm，高度为35 cm。在每个小区中间放置一个采气箱。箱上安装有橡胶塞，用注射器抽取气体。在气体采集时，高35 cm的静态箱嵌入圆环底座的凹槽中，凹槽倒入适量水作空气密封，扣箱后用60 mL塑料注射器于0、15、30、45、60 min抽取箱内气体。用12 mL的真空瓶收集气体，N2O利用气相色谱分析。

为研究土壤理化性质对N2O年累积排放的影响，在翻耕处理实施一年后（2015年7月）采集表层0~10 cm混合土壤样品和原状土壤样品。在每个小区内随机采集5个样点的土样并混合均匀，即为混合土壤样品。混合土样带回实验室保存在4 ℃的冰箱以备后续测定。混合土样测定分成两部分，一部分鲜样过10 mm筛，用于测定土壤微生物生物量碳（MBC）、铵态氮（NH4

+）和硝态氮（NO3¯）。另一部分风干后过0.15 mm筛，用于测定土壤总氮（TN）、pH、交换性钙离子（Ca2+）及砂粒含量。原状土采集和处理方法为：用刀移除土壤表层杂物，在每个小区左下角取高、长、宽为10 cm×15 cm×12 cm的整个土块，尽量不使土体结构被破坏，放置在硬质保鲜盒带回实验室。采回的原状土在室内沿自然裂隙小心掰成直径约8 mm的小土块，除去植物残体，小石块以及蚯蚓等，为后续的团聚体分级做准备。

1.4 样品测定与计算

气体样品分析：采用气相色谱仪分析N2O的浓度；N2O检测器为电子捕获检测器（ECD），载气为N2，流量为30 mL/min，检测器温度为300 ℃，分离柱温度为55 ℃；通过测定5个气样浓度进行线性回归，得出气体排放速率，进而求出气体的排放通量[22]；当N2O测定分析出现负通量时，进行有效数据的质量控制，具体参考郑循华和王睿[23]文献。

N2O的排放通量计算公式为：

式中：F为N2O排放通量（以N计）（mg/(m2·h)）；ρ为标准状态下的密度（1.98 kg/m3）；V为密闭箱内有效的空间体积（m3）；A为密闭箱覆盖的水面面积（m2）；Δc为N2O气体浓度差（表示为占空气的体积分数）；Δt为采样的时间间隔（h）；T为采样时密闭箱的温度（℃）。

N2O累积排放量计算：

式中：Ec为N2O累积排放量（mg/m2）；F为N2O排放通量（mg/(m2·h)）；ti+1-ti为第i和i+1次采样的时间间隔（d）；n为观测期间总测定次数。

土壤样品分析：团聚体分离参考干筛过程[24]：将土样放置在一套网筛上（2 mm和0.25 mm），用干筛仪器进行分离，振幅1.5 mm，振动2 min。对各层筛子上土样进行收集，土壤团聚体被分成>2 mm、0.25~2 mm和<0.25 mm 3个粒级。TN含量采用碳氮元素仪（Vario MAX CN，Elementar, Germany）测定。NH4+和NO3¯用2 mol/L KCl浸提，连续流动分析仪（AA3, SEAL, Germany）进行测定。土壤MBC测定采用熏蒸浸提法[25]，用0.5 mol/L K2SO4浸提，浸提液里总有机碳用TOC分析仪（Model TOC-VCPH,Shimadzu, Tokyo, Japan）测定，具体计算公式为：MBC=EC/kEC，式中EC为熏蒸土壤提取的有机碳减去不熏蒸土壤提取的有机碳，kEC为转换系数，取值0.45[26]。土壤pH采用pH计测定。Ca2+含量采用原子吸收光谱仪（Avanta M，GBC，澳大利亚）测定。

1.5 土壤温度和含水量监测

土壤温度动态利用纽扣式温度记录仪（iButton，DS1990A-F5 ；Maxim Integrated，美国）监测，埋设深度为地表以下5 cm。土壤湿度的测定采用鲜土烘干法，每隔一个月，用铝盒采集0~10 cm深度处的土壤样品，称取鲜土重后于105 ℃烘干至恒重，再称取烘干土的重量，计算可得土壤重量含水量。

1.6 数据分析与处理

数据统计在分析前进行正态分布和方差齐次性检验。利用单因素方差分析（ANOVA）比较不同翻耕频率下N2O月排放量、季节排放量及土壤性质的差异，利用双因素方差分析（Two-way ANOVA）比较翻耕处理和采样月份对N2O累积排放量、土壤月温度及含水量的影响，采用Duncan方法检验显著性水平，在5%显著性水平下确定显著性。利用Pearson相关分析评价土壤性质与N2O累积排放量的关系。采用多元线性逐步回归方法分析土壤性质对N2O累积排放量解释变量的贡献。采用结构方程模型（SEM）探讨翻耕扰动下土壤性质对N2O排放的影响路径。SEM只包括与N2O累积排放量显著相关的土壤性质，为避免模型信息冗余，以相关性更好的NO3¯代表底物；采用团聚体>2 mm和0.25~2 mm主成分降维，用第一轴的结果代表团聚体。采用P值、χ2、拟合优度指数（GFI）和均方根近似误差（RMSEA）评估结构方程模型拟合[27]。为了确保数据符合SEM中的正态性假设，所有数据进行标准化转化。SEM分析采用Amos 21.0，其他统计均在SPSS 16中实现。

2 结果与分析

2.1 翻耕扰动下N2O排放量的变化规律

由图2可知，中高频翻耕处理（T2、T3和T4）的N2O月排放量整体低于免耕处理（T0）。土壤N2O月排放量在10月到次年3月较低，为1.97~ 8.84 mg/m2；在4月到9月较高，为3.13~ 25.52 mg/m2。双因素方差结果表明翻耕处理显著影响N2O月排放量，且由于采样月份不同，N2O月排放量有显著差异（P<0.001）。

N2O年累积排放量表现为：T2、T3和T4显著低于T0（P<0.05），分别降低29.37%，37.30%和29.55%；T1和T0无显著差异（图3）。这表明相比免耕，中高频翻耕显著减少土壤N2O年累积排放量。各处理累积排放的季节变化规律一致，均为夏季>春季>秋季>冬季。夏季的N2O累积排放量在T1处理呈现最高值，其他处理均无显著差异；春季和秋季的N2O累积排放量为T2、T3和T4显著低于免耕；冬季的N2O累积排放量在所有处理中无显著差异。

2.2 翻耕扰动对土壤性质的影响

翻耕扰动对土壤温度及含水量的影响（图4）：双因素方差结果显示土壤温度和含水量因采样月份不同而差异显著（P<0.001）；翻耕处理显著影响土壤温度，而对土壤含水量无显著影响。单因素方差分析表明在2014年7月、8月、9月、11月及2015年1月不同翻耕处理之间土壤温度差异显著。

经过一年翻耕扰动后土壤理化性质特征为：随翻耕频率增加，土壤团聚体>2 mm呈降低趋势，0.25~2 mm呈增加趋势。土壤总氮、硝态氮及可溶性有机氮均在T0处理下为最高值，T1、T2和T3次之，T4为最低，这表明翻耕扰动减少了土壤氮素。MBC和砂粒含量随翻耕频率增加而依次降低（表1）。

表 1 一年翻耕实验后土壤性质特征Table 1 Soil properties after one-year ploughing experiment

2.3 土壤温度和水分对N2O月排放量的影响

土壤温度、水分与N2O每月累积排放量之间的关系如图5所示：各翻耕处理下N2O累积排放量随土壤温度升高而呈指数增长，且与温度达到极显著相关水平（P<0.001）；各翻耕处理下N2O累积排放量随土壤含水量升高而呈二次方程关系变化，各处理均达到极显著相关水平。

2.4 土壤性质对N2O累积排放量的影响

N2O累积年排放量与土壤TN、NO3¯、MBC呈极显著正相关（P<0.01），与团聚体粒级>2 mm呈显著正相关（P<0.05），与0.25~2 mm呈显著负相关（表2）。这表明翻耕扰动下土壤TN、NO3¯、MBC和团聚体（>2 mm和0.25~2 mm）是影响N2O年累积排放量的因素。土壤多元逐步回归分析剔除对N2O年累积排放影响不显著及共线性因子，得出回归方程N2O=0.662MBC，R2=0.407，F=14.05，P=0.001。这表明MBC对N2O排放有较大的解释度，能单独解释N2O排放量变异的40.7%，是影响土壤N2O排放的主导驱动因素。结构方程模型合理地拟合了我们的假设（χ2= 0.308，DF= 1，P= 0.579，GFI= 0.994，RMSEA<0.001），并解释了N2O年累积排放量总方差的48%（图6）。结构方程模型结果表明，翻耕扰动主要通过调控土壤MBC，进而影响N2O年累积排放量；NO3¯对N2O年累积排放量有直接作用，也可通过MBC间接影响N2O排放。因果模型直接和间接影响的详细信息见图7。

表2 土壤性质与N2O年排放量的相关性Table 2 Relationships between soil properties and annual N2O emission

3 讨论

3.1 翻耕扰动对土壤N2O排放的影响

我们研究表明，中高频翻耕显著减少土壤N2O年排放总量（图3）。一般而言，翻耕措施会增加土壤的通气性，过多曝气条件不利于反硝化作用，从而导致土壤N2O排放量降低[3]；另一方面，高强度翻耕加剧土壤氮素损失，造成反硝化作用的底物减少，进而限制土壤N2O排放[4]。然而，很多研究者持相反观点，认为由耕作引起的适当土壤扰动能提供适宜的曝气条件，给N2O变成N2前提供更好的扩散逃逸机会，从而增加N2O排放[5]。适当土壤扰动也能一定程度破坏大孔隙和大团聚体，降低孔隙度并形成缺氧环境，同时暴露更多土壤有机物，为反硝化提供能量和底物供应，造成较高的反硝化速率，促进N2O产生和排放[6]。此外，孙钰翔等[7]通过盆栽实验表明搅动处理的红壤水稻土N2O总排放量显著高于不搅动处理，而搅动对湖白土的N2O排放无显著影响。以上均说明翻耕措施对土壤N2O排放的影响规律不仅与翻耕强度有关，还与土壤性质密切相关。我们试验中模拟翻耕使用的梨耕是喀斯特当地习惯耕作方式。相对于凿耕等保护性耕作，梨耕为传统翻耕，对土壤扰动程度较大；并且研究区土壤属于壤土，本身通气条件较好，翻耕措施容易使土壤过度曝气，降低N2O排放。

3.2 土壤温度和含水量对N2O排放变化的影响

随土壤温度增加，各翻耕扰动下N2O累积排放量均呈指数增长（图5）。以往研究表明，一定温度范围内土壤N2O排放速率随着土壤温度增加而升高[8]，这主要是由于较高温度能增强微生物活性，特别是硝化和反硝化菌，进而促进N2O排放。但也有研究表明，在低温环境下土壤温度和N2O排放量关系并不明确，伍延正等[21]对不同土地利用方式下冬季土壤N2O排放研究发现，当温度>5 ℃时，N2O排放量与土壤温度呈显著正相关，但温度<5 ℃时二者无显著关系。这可能是由于低温范围内，土壤温度变化对微生物活性（如反硝化细菌）影响较小[9]。由于我们研究区全年气温在较高范围内，因此N2O排放量随土壤温度增加而呈现上升规律。此外，本研究中土壤含水量与N2O累积排放量为二次方程关系，呈先增加后降低趋势。土壤含水量的提高通常能引起土壤N2O大量排放[28]。因为土壤水分状况决定了大气和土壤之间的O2交换和可用性，从而控制反硝化过程和N2O排放[29]。但当土壤含水量达到高水平时，虽然反硝化作用加强，但土壤通气性变差，同时也限制了O2的可用性，导致N2O向大气扩散受阻，进一步被完全还原成N2，反而削弱了N2O的排放[30]。

3.3 土壤生物地球化学性质对N2O排放的影响

以往研究表明，拥有较多大团聚体的土壤往往比拥有较多微团聚体的土壤排放更多N2O[10]。因为大团聚体能保持较高水分含量，降低O2通透性，形成厌氧内核促进N2O产生[31]。这与我们的研究结果一致，N2O年累积排放量与>2 mm大团聚体呈显著正相关，与0.25~2 mm小团聚体呈显著负相关。但有研究者持相反观点，耕地中分离的小团聚体能够释放更高的N2O，主要是由于土壤小团聚体具有较高的表面体积比，其有效碳氮基质暴露在微生物的比例较高，是硝化菌和反硝化菌生长偏好的微环境[11]。其他也有研究表明，土壤N2O排放量和团聚体粒级大小没有密切关系[32]，因为在实际耕作环境中，土壤压实作用比团聚体更能影响土壤通气性，进而决定N2O排放[33]。我们翻耕模拟试验中，由于压实活动较少，土壤N2O排放主要受团聚体粒级影响。

土壤NO3¯和NH4+作为基质，是N2O排放的主要来源[12]。我们的研究结果显示，N2O累积排放量与土壤NO3¯呈极显著正相关。亚热带茶园N2O排放规律研究中也发现类似结果，土壤NO3¯与N2O排放呈显著正相关，土壤NO3¯对N2O排放变化有较大的解释率[8]。Qiu等[13]也指出，土壤N2O排放与矿质氮线性相关，表明矿质氮为反硝化提供了更多基质，对土壤N2O排放产生了积极影响。本研究中与土壤N2O排放密切相关的矿质氮是NO3¯，但与NH4

+无显著相关性。这主要是由于喀斯特地区石灰土高pH，促进土壤NH4+硝化产生NO3¯，从而抑制NH4+在土层中积累[34]。其他研究也显示土壤环境发生改变时，N2O排放的变化很大程度上取决于土壤NO3

¯含量[35]。SEM模型表明，NO3¯除了作为基质的直接作用外，还可以通过改变土壤微生物间接影响N2O排放（图6），这与Li等[36]研究结果一致。土壤氮基质的增加会改变土壤微生物生物量，进而影响反硝化速率[37]。

土壤MBC是土壤微生物生物量的表征之一，对许多微生物驱动的过程有显著影响[38]，对土壤N2O排放具有积极作用[14]。我们研究表明，翻耕扰动下MBC是影响土壤N2O排放的主导驱动因素，能作为N2O排放的有力预测因子。这与诸多报道一致[14-15]，随着土壤微生物生物量的增加，生物活性可能刺激生物化学过程，如反硝化作用，进而增加N2O的产生[15]。然而Lin等[39]指出，水稻田、林地和丘陵山地的土壤MBC与N2O排放均具有显著正相关，而在果园中二者无显著相关性。学者们指出虽然大范围生态系统中氮转化与微生物生物量呈正相关[40]，但实际上土壤N2O排放主要由特定的硝化微生物和反硝化微生物来决定[41]。当土壤采用特殊管理措施（例如覆盖作物或施用肥料）时，会对特定功能性微生物种群产生重大影响[42]，从而破坏微生物生物量与氮转化的密切关系。

4 结论

1）双因素方差结果显示，N2O月排放量受翻耕影响，并且因采样月份不同而差异显著。各处理的土壤N2O累积排放量在夏季最高，其次是春秋季，冬季最低。N2O年累积排放量表现为中高频翻耕（T2、T3和T4）显著低于免耕，低频翻耕（T1）略高于免耕，但无显著性。各处理N2O累积排放量与土壤温度呈指数增长关系，与土壤含水量呈二次方程关系，且各处理均达到极显著相关水平。

2）Pearson相关性分析表明，团聚体(>2 mm和0.25~2 mm)、总氮、NO3¯及MBC均 与N2O年累积排放量有显著相关性，是影响土壤N2O排放的因素。多元逐步回归显示，MBC能单独解释土壤N2O排放变异的40.7%。SEM模型显示，翻耕扰动主要通过调控土壤MBC进而影响N2O年累积排放量；NO3

¯对N2O年累积排放量有直接作用，也可通过MBC间接影响N2O排放。以上表明土壤MBC是翻耕作用下影响N2O排放的主导因素。