右美托咪定对结肠癌细胞p38MAPK/NF-κB信号通路的影响

文竹，李军，张永洪，黄婧

结肠癌(colorectal Cancer，CRC)是一种世界范围内最普遍的恶性肿瘤，起源于结肠组织，近年CRC的发病率在世界范围不断增加[1-2]。手术或手术结合放化疗或靶向治疗为CRC患者的主要治疗策略[3]，当癌细胞具有转移特性时，积极采用多方式联合治疗可明显延长CRC患者的生存时间[4-6]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一种镇痛药物，具有抗应激、抗炎症的功效[7-8]。近年研究显示，Dex还具有抗肿瘤活性，如Dex可以抑制卵巢癌细胞NUTU-19中p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)信号通路激活，有效改善炎症，提高细胞的免疫能力[9]。Dex还可通过p38MAPK/NF-κB信号通路抑制骨巨细胞瘤细胞的增殖与迁移[10]。已有研究证实，Dex应用于CRC手术镇痛效应好，且可以改善血流动力学，保护心脑功能[11]，但是Dex对CRC细胞的影响，其机制是否涉及p38MAPK/NF-κB信号通路，均不清楚。因此本实验采用不同浓度Dex及p38MAPK/NF-κB信号激活剂处理CRC细胞，在体外探究Dex对CRC细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

人CRC细胞Caco2，购于中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂及仪器

右美托咪定注射液购于扬子江药业公司；GibcoTMDMEM高糖培养液购于Thermo公司；LPS购于上海碧云天；双抗购于Hyclone公司；CCK-8、Annexin V-FITC/ PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购于上海生工公司；p53、ki-67、Bax、Bcl-2、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB、NF-κB、GAPDH兔源抗体、羊抗兔IgG购于美国Abcam公司。细胞培养箱购于中新医疗仪器有限公司；倒置显微镜购于Olympus公司；细胞计数器购于艾力特生命科学(上海)有限公司；酶标仪、流式细胞仪购于Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 取人CRC细胞Caco2细胞株，于常温下融化后移至T 25培养瓶中，轻柔吹打Caco2细胞，待其充分悬浮后，用含1%双抗、10%胎牛血清混合液的DMEM培养液进行培养，细胞培养箱气象条件设置为5% CO2、95%O2，温度设置在37℃。2 d更换一次培养液；Caco2细胞融合度达到80%时可进行传代培养，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，消化至细胞从瓶壁脱落后分瓶并传代培养。

1.3.2 分组

取对数生长期的Caco2细胞，随机分为对照组(常规培养)、Dex低剂量组(1 μmol/L Dex培养液)[12]、Dex高剂量组(3 μmol/L Dex 培养液)、激活剂组(5 μg/mL LPS)[13]、Dex高剂量+激活剂组(3 μmol/L Dex 培养液与5 μg/mL LPS)，各组细胞按照不同给药剂量进行处理，以1.3.1中培养条件进行培养。

1.3.3 CCK-8检测Caco2细胞增殖情况

取1.3.2中各组对数生长期Caco2细胞，将Caco2细胞浓度调整为5×104个/孔，培养于24孔培养板中，每组设置3个复孔，分别继续培养48 h时后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，此过程中所有培养条件设置为5% CO2，95% O2，温度设置在37℃，于细胞培养箱中进行培养。培养结束后使用酶标仪测定每孔Caco2细胞的吸光度(OD)值，并计算细胞增殖率，细胞增殖率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.4 流式细胞仪检测Caco2细胞凋亡情况

取1.3.2中各组对数生长期Caco2细胞，300 g离心5min，收集Caco2细胞，使用PBS洗涤Caco2细胞后，将Caco2细胞浓度调整为2×105个，300g离心5min弃上清，加入1×Annexin V Binding Buffer工作液重悬各组Caco2细胞，再向各组Caco2细胞中加入5 μL的AnnexinV-FITC(标记细胞)和5 μL的PI(染色液)进行染色，将混匀的混合溶液，避光染色1 h后于细胞流式仪检测细胞凋亡情况。

1.3.5 Western blot增殖、凋亡及p38MAPK/NF-κB通路蛋白的表达

取1.3.2中各组对数生长期Caco2细胞，弃去培养基，按照全蛋白提取试剂盒说明书，加入裂解液，裂解30分钟获取总蛋白。使用BCA蛋白试剂盒检测总蛋白浓度，SDS-PAGE分离等量蛋白质，按照湿转法将分离的蛋白转移至硝酸纤维膜上，加入封闭液脱脂牛奶封闭1 h，添加p53、ki-67、Bax、Bcl-2、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB、p-NF-κB、GAPDH兔源一抗在4℃下孵育过夜，TBST洗涤3次胶后添加羊抗兔IgG(1∶ 1000)常温下孵育1 h。采用蛋白成像凝胶仪对增殖(p53、ki-67)、凋亡(Bax、Bcl-2)及p38MAPK/NF-κB通路蛋白条带拍照并半定量分析。

1.4 数据统计与分析

2 结果

2.1 不同浓度的Dex对Caco2细胞增殖能力的影响

与对照组相比，Dex低、高剂量组Caco2细胞细胞增殖率显著降低(P<0.05)，激活剂组Caco2细胞细胞增殖率显著增加(P<0.05)；与Dex高剂量组相比，Dex低剂量组、Dex高剂量+激活剂组Caco2细胞细胞增殖率显著增加(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度Dex对Caco2细胞增殖能力的影响

2.2 不同浓度的Dex对Caco2细胞凋亡的影响

与对照组相比，Dex低、高剂量组Caco2细胞细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，激活剂组Caco2细胞细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与Dex高剂量组相比，Dex低剂量组、Dex高剂量+激活剂组Caco2细胞细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见表2、图1。

表2 不同浓度的Dex对Caco2细胞凋亡的影响

图1 不同浓度的Dex对Caco2细胞凋亡的影响。A：对照组；B:Dex低剂量组；C:Dex高剂量组；D：激活剂组；E:Dex高剂量+激活剂组

2.3 不同浓度的Dex对Caco2细胞中增殖与凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，Dex低、高剂量组Caco2细胞中Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2显著升高(P<0.05)，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)，激活剂组Caco2细胞中Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05)，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)；与Dex高剂量组相比，Dex低剂量组、Dex高剂量+激活剂组Caco2细胞Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05)，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，见表3、图2。

图2 不同浓度的Dex对Caco2细胞中增殖与凋亡相关蛋白表达的情况 A：对照组；B:Dex低剂量组；C:Dex高剂量组；D：激活剂组；E:Dex高剂量+激活剂组

2.4 不同浓度的Dex对Caco2细胞中p38MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，Dex低、高剂量组Caco2细胞中p-p38MAPK、p-NF-κB水平降低(P<0.05)，激活剂组Caco2细胞中p-p38MAPK、p-NF-κB水平显著升高(P<0.05)；与Dex高剂量组相比，Dex低剂量组、Dex高剂量+激活剂组Caco2细胞中p-p38MAPK、p-NF-κB水平显著升高(P<0.05)，见表4、图3。

3 讨论

CRC在中国是前五位确诊癌症和因癌死亡原因之一[14]。虽然治疗方法不断改进，结肠癌患者的总体5年相对生存率仍不高，约为64%[15]。因此，医学界仍在寻找CRC治疗的新方式。Dex为高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，经常作为镇痛剂使用[7]，对手术治疗的CRC患者使用Dex不仅可有效镇痛，还可改善患者凝血功能和免疫能力[16]。且研究显示，Dex可以抑制胃癌细胞株的增殖，减轻移植瘤质量，并促进其自噬和凋亡[17]。本实验将Dex作用于体外培养的CRC细胞，发现Dex对Caco2细胞也具有抑增殖、促凋亡作用。p53是多种增殖功能调节剂，其高表达可促进癌症的发生与发展[18]。ki-67广泛用作临床癌症组织病理学的癌细胞增殖标志物，其高表达可以显著促进癌细胞的增殖[19]。抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax是调节细胞凋亡和生存的重要蛋白，同属于Bcl-2家族，Bax/Bcl-2增加是细胞凋亡的启动因素，二者的表达情况与细胞凋亡密切相关[20]。本研究发现，与对照组相比，Dex低、高剂量组Caco2细胞中Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2升高，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平降低，且高剂量Dex作用更显著，进一步证实提示Dex可以抑制Caco2细胞株增殖，促进Caco2细胞株凋亡。

图3 p38MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达情况 A：对照组；B:Dex低剂量组；C:Dex高剂量组；D：激活剂组；E:Dex高剂量+激活剂组

表3 不同浓度的Dex对Caco2细胞中增殖与凋亡相关蛋白表达的影响

表4 Dex对p38MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达的影响

p38MAPK/NF-κB信号通路可将外部信号从细胞膜传递到细胞核，控制一系列生物学功能，包括细胞凋亡、增殖和分化，参与调控CRC等肿瘤进展[21-23]。抑制MAPK和NF-κB等关键蛋白激活可调节凋亡蛋白和存活蛋白诱导细胞凋亡，抑制肝癌、膀胱癌等进展[24-25]。本实验发现，与对照组相比，Dex低、高剂量组Caco2细胞中p-p38MAPK、p-NF-κB蛋白水平显著降低，表明Dex可以抑制Caco2细胞中p38MAPK/NF-κB信号通路活化，可能是其促进Caco2细胞凋亡、抑制其增殖的机制。另外，与Dex高剂量组相比，Dex高剂量+激活剂组Caco2细胞凋亡率及Bax蛋白水平显著降低，细胞增殖率、p-p38MAPK、p-NF-κB、p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平显著升高，表明激活剂可以逆转Dex对Caco2细胞增殖和凋亡的调节作用，因此，Dex可能通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路来抑制Caco2细胞增殖，促进Caco2细胞凋亡，推测在CRC手术治疗时采用Dex麻醉可能有利于预后。

综上所述，Dex可抑制人CRC细胞Caco2的增殖，并促进其凋亡，可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关，但本实验未进行体内验证，因此仍需深入研究。