连花柴芩可溶性粉对鸡风热犯肺证的临床试验研究

王学方，归 荣，陈功义，王 伟2,，张红英，王学兵，李 晓

(1.河南农业大学动物医学院,郑州 450000；2.河南省纳普生物技术有限公司，郑州 450002；3.河南农业职业学院，郑州 451450；4.河南省科学院，郑州 450002)

呼吸系统疾病是畜禽养殖中的常见和多发类疾病，特别是在集约化养殖中，呼吸系统疾病已成为制约中国养殖业发展的一个重要因素。上呼吸道感染是畜禽生产实践中最常见的呼吸系统疾病，控制上呼吸道感染及其并发、继发感染已成为各个养殖群体疫病防控的重要目标。目前，对上呼吸道感染的治疗，临床上多以抗菌、抗病毒、解热镇痛等化学药物治疗为主，但不能获得理想疗效，且易造成抗生素滥用、药物残留，不利于长期治疗[1]。中兽药具有作用多靶点、低残低毒、不易产生耐药性等优点[2-4]，在治疗上呼吸道感染方面有着较强的应用优势。从中兽医理论分析，禽上呼吸道感染辨证多为六淫或疫疠等病邪侵袭肺卫而造成的肺经外感疾病[5]。鸡风热犯肺证多见于上呼吸道感染初期，风温病初起，正气不足以御邪，风热病邪乘虚侵入肺卫，以致卫气被郁、肺失宣降所表现的证候。病机由外感风热、肺气壅阻、失于清肃所致，邪在肺卫，由于鸡的生理特点，病邪易内郁、从阳化热，可快速向内传及到气分受病，出现卫、气同病或表里同病。病禽主证表现为缩颈乍毛、不愿走动、发热、流涕、咳嗽、气管啰音、张口呼吸、口渴、食欲降低等症状。据辨证论治体系的理、法、方、药，对本证应疏散风热，治热防变，同时清肺止咳，截断病势传变。

连花柴芩可溶性粉是由连翘、山银花、柴胡、黄芩、紫苏叶、甘草六味制成的中兽药可溶性粉剂，连翘[6-8]、山银花[9]为君药，既辛凉解表、疏散表邪，还可清热解毒、攻除里热；柴胡[10]苦平、疏肝解郁、和解退热、升举阳气，黄芩[11-12]苦寒，清热燥湿，泻火解毒，两药一升清一降浊，配伍使用，清解半表半里之邪，和解少阳、调畅枢机、使郁热有外达之机为臣药；紫苏叶[13]祛风解表、行气和胃，甘草[14]补脾益气、祛痰止咳、调和诸药共为佐使。全方合用，共清热解毒、宣肺止咳之效。本试验旨在研究连花柴芩可溶性粉对风热犯肺所导致的鸡发热、咳嗽、食欲减退、口渴喜饮等证候的临床疗效并初步探讨其机制，以期为中兽药在风热犯肺证的治疗中提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)IBV-M41标准毒株购自中国兽医药品监察所，批号：AV1511，实验室测定其鸡胚半数感染量(EID50)为10-6.32/0.1 mL。

1.1.2 药物 连花柴芩可溶性粉由河南中亚神鹏医药科技有限公司提供，批号：20190826；麻杏石甘颗粒购自河北瑞高动物药业有限公司，批号：19100802；经河南省兽药监察所检验均符合标准。

1.1.3 主要试剂 RPMI-1640培养基购自HyClone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；10 kU/mL青霉素、10 mg/mL链霉素均购自北京雷根生物技术有限公司；L-谷氨酰胺购自WOLSEN公司；刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)均购自Sigma-Aldrich公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗鸡CD3-FITC、CD4-PE和CD8a-PE、鼠抗人IgG1-FITC和IgG1-PE单克隆抗体均购自艾美捷科技有限公司。

1.1.4 试验动物 1日龄AA白羽肉鸡公雏购自河南省开封市兴达禽业有限公司。常规饲养至15日龄供试验用。试验期间未做鸡传染性支气管炎疫苗免疫。饲料购于河南省金诺饲料有限公司，为不含任何抗生素及其他抗病促生长药物的雏鸡全价饲料。

1.2 方法

1.2.1 鸡风热犯肺证模型的建立

1.2.1.1 IBV种毒复壮 IBV标准株M41在使用前用鸡胚复壮。种毒用灭菌PBS液10倍稀释，经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，0.1 mL/胚，37 ℃培养72 h，收集鸡胚尿囊液，加入青霉素1 000 IU/mL、链霉素1 mg/mL混匀，以3 000 r/min离心30 min，取上清液-40 ℃保存备用。以上述方法盲传3代，试验用毒种为IBV第3代病毒，EID50为10-6.32/0.1 mL。

1.2.1.2 攻毒量筛选 1日龄健康AA白羽肉鸡公雏50只，饲养至15日龄，随机分成5组，10只/组，取经鸡胚盲传3代进行复壮的IBV-M41病毒液进行10倍稀释，分别以0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL/羽的剂量对雏鸡滴鼻点眼进行攻毒。攻毒前12 h，将鸡舍室温调至20 ℃，并室内喷淋冷水使相对湿度保持在70%以上。试验组攻毒后自由饮水采食，试验期间不接种任何疫苗。观察攻毒后每组鸡的临床症状，确定建立鸡风热犯肺证模型的攻毒量。

1.2.1.3 诊断标准 根据《中兽医学》[15]和《中兽医基础理论》[16]脏腑辨证中风热犯肺证的诊治原则，结合《中医内科病证诊断疗效标准》[17]、《中药新药临床研究指导原则》[18]和《兽药研究技术指导原则汇编》[19]中风热犯肺证的诊断标准及鸡的生理特征，风热犯肺证主证为咳喘、发热；次证包括口干咽痛、鼻塞流涕、食欲下降等，制定了本试验鸡风热犯肺的诊断标准为：①精神沉郁、羽毛蓬乱、反应迟钝；②发热，体温>41.5 ℃；③咳嗽、打喷嚏、甩头、流涕、气管啰音或张口呼吸；④食欲不振、饮水增加。

1.2.1.4 病例纳入标准与排除标准 本试验设置精神状态、体温、呼吸道3项指标对风热犯肺主证，采用分别量化分级评分法，将病鸡临床症状分为无症状、症状轻、中、重，分别记0、1、2、3分。各项指标的积分权重方面，考虑到精神状态人为判断的主观因素影响，积分权重应较低，设为10%；呼吸道症状权重比体温权重稍高，二者分别设为50%和40%。最终积分评定按各指标积分权重，计算总积分。具体各指标对应积分情况见表1。

表1 各指标积分标准

纳入标准：符合鸡风热犯肺证临床试验动物诊断标准(用药前总积分≥1)。

排除标准：①不符合上述标准的发病鸡；②鸡群发病突然，且死亡率超过50%；③发热至体表皮肤尤其是冠髯严重发绀；④伴轻中度以上腹泻；⑤残疾、受伤、弱小的鸡。

1.2.2 动物分组与处理 临床健康15日龄AA白羽肉鸡，采用10倍稀释的IBV-M41第3代鸡胚尿囊液滴鼻点眼染毒，0.3 mL/只。于攻毒前12 h，将鸡舍室温调至20 ℃，并于室内喷淋冷水使相对湿度保持在70%以上。攻毒2 d后选择符合风热犯肺证纳入标准的试验鸡150只，随机均分为5组，30只/组，分别为：连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组，根据试验前期用药剂量的筛选结果，连花柴芩可溶性粉浓度分别设为4、2和1 g/L)、药物对照组(麻杏石甘颗粒,1 g/L)、模型对照组，另设30只为健康对照组。健康对照组与其他各组分开饲养，各组饲养条件一致。连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组、药物对照组采用饮水给药方法，连续给药5 d，每天给药1次。模型对照组和健康对照组不用药物，自由饮水和采食。

1.2.3 疗效评价 结合主证与次证，综合评价连花柴芩可溶性粉用于鸡风热犯肺所致的发热、咳嗽、食欲下降、口渴喜饮的临床效果。

1.2.3.1 主证指标与疗效评价标准 ①精神状况：观察每只试验鸡的精神、羽毛状态，按照积分标准记录每只鸡得分；②体温：测量每只试验鸡给药前及给药1、2、3、4、5 d后的体温，按照积分标准记录每只鸡得分；③呼吸道症状：观察每只试验鸡给药前及给药5 d中的呼吸道症状，按照积分标准记录每只鸡得分，计算每组的呼吸道症状评分百分比；④疗效评价标准：根据以上评分标准，评价每只存活鸡给药前后的积分情况，计算疗效指数。疗效判定标准以疗效指数表示。临床疗效判定标准见表2。根据临床疗效判定标准统计治愈数、有效数和无效数。

呼吸道症状评分百分比(%)=每组症状评分总和/每组中最大可能的症状评分总和×100%

疗效指数(%)=(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分×100%

1.2.3.2 采食、饮水等次证指标考察 由于鸡采食、饮水量不易精确到个体，所以试验期间通过记录每组鸡的采食饮水量，对风热犯肺次证进行临床疗效评价。各试验组鸡，记录每天饲料、饮水的给予量与剩余量，计算各试验组鸡的平均采食量、平均饮水量；分别在给药前、给药后第5天上午8:00到10：00逐只称取每只存活鸡体重，计算各组平均体重，计算体增重。

1.2.4 免疫指标

1.2.4.1 免疫器官指数 试验各组于停药后第5天，每组随机抽取10只鸡剖杀，称重，摘取胸腺、法氏囊及脾脏并称重，计算免疫器官指数。

免疫器官指数(mg/g)=试验结束时的免疫器官重量(mg)/体重(g)

1.2.4.2 鸡外周血T细胞亚群 各试验组于用药前、停药后第1和5天，每组随机取10只鸡，翅下静脉无菌采血，肝素抗凝后，将抗凝血样与D-Hank’s液1∶1混匀进行稀释，再取稀释血样沿试管壁缓慢加在同等体积淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，分离淋巴细胞，用PBS将细胞数调至5×106/mL。一管加入鼠抗鸡CD3-FITC、CD4-PE单克隆抗体各10 μL，另一管加入CD3-FITC、CD8a-PE单克隆抗体各10 μL，相应对照管加入鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE单克隆抗体各10 μL，再分别加入淋巴细胞悬液50 μL，混匀，4 ℃避光作用20 min。加入PBS 500 μL，混匀，室温避光作用10 min，1 500 r/min离心10 min，弃去上清，再加入PBS 500 μL，重悬细胞，流式细胞仪检测，得出CD3+、CD4+、CD8+百分数。

1.3 数据统计分析

将各项指标进行数据统计，计数资料以χ2检验分析；计量资料采用SPSS 18.0软件进行方差分析，差异显著时进行Duncan’s多重比较。结果用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 鸡风热犯肺证模型的建立

攻毒后，第1天鸡开始出现精神沉郁、羽毛松乱现象，第2天出现咳嗽、打喷嚏、触诊发热，夜间观察能听到明显的湿性气管啰音，严重者伸直头颈，因呼吸困难而张口呼吸，鸡群采食欲下降，饮水增加，攻毒后第7天剖检病鸡发现其气管部有浆液、黏液性渗出物，气管环出血，肺脏出血。

比较不同攻毒量发病情况，接种0.1～0.2 mL IBV-M41病毒液后雏鸡发病率为80%以上；接种0.3 mL的鸡群发病率为100%，呼吸道症状明显；接种0.4 mL的鸡群发病率为100%，表现出严重的呼吸道症状。故确定每羽接种0.3 mL经10倍稀释的IBV-M41第3代鸡胚尿囊液为本试验的攻毒剂量。

试验鸡于攻毒2 d后临床症状明显，病鸡主要表现为精神不振或萎靡，羽毛蓬乱，扎堆，翅膀下垂，闭目呆立，食欲下降，饮水欲增加，体温升高，流涕，打喷嚏，咳嗽，夜间观察能听到明显的气管啰音，严重者伸直头颈，张口呼吸，符合风热犯肺证候表现。

2.2 疗效评价

2.2.1 主证指标

2.2.1.1 各组鸡体温变化 由表3可知，在攻毒2 d后，除健康对照组外，各试验组鸡体温均超过正常体温，处于发热状态。在给药后3 和5 d，连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组及药物对照组体温均显著低于模型对照组(P<0.05)，但仍显著高于健康对照组(P<0.05)，高、中剂量组体温显著低于药物对照组(P<0.05)。

表3 各组鸡体温变化

2.2.1.2 各组鸡呼吸道症状 攻毒1 d后鸡群陆续发病，迅速波及全群，攻毒后第2～3天，各攻毒试验组呼吸道症状程度到达高峰。

给药后3 d，连花柴芩可溶性粉各试验组和药物对照组呼吸道症状呈减轻趋势；用药后5 d，连花柴芩可溶性粉各试验组和药物对照组呼吸道症状大幅好转，高、中剂量组呼吸道症状程度较轻。用药前后共6个时间点的呼吸道症状百分比见图1。

图1 各组鸡呼吸道症状评分变化

2.2.1.3 主证临床疗效 依据疗效判定标准，统计各试验组的治愈数、有效数与无效数，计算治愈率、有效率及无效率(总有效率为治愈率和有效率之和)，结果见表4。比较各治疗组的总有效率，以连花柴芩可溶性粉高、中剂量组较好，总有效率分别为90.00%和86.66%，显著高于模型对照组(P<0.05)。连花柴芩可溶性粉高、中剂量的治愈率、有效率与总有效率均无显著差异(P>0.05)。

表4 连花柴芩可溶性粉的临床疗效结果

2.2.2 次证指标

2.2.2.1 各组鸡采食量 攻毒2 d后，除健康对照组外，各试验组鸡均出现采食量下降趋势。给药后3 d，连花柴芩可溶性粉高、中剂量组鸡采食量与模型对照组相比显著提高(P<0.05)，且高、中剂量鸡采食量显著高于药物对照组(P<0.05)；给药后5 d，连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组、药物对照组鸡采食量均显著高于模型对照组(P<0.05)，其中高剂量组与健康对照组无显著差异(P>0.05)(表5)。

表5 连花柴芩可溶性粉对鸡平均采食量的影响

2.2.2.2 各组鸡饮水量 给药前，各试验组鸡饮水量无显著差异(P>0.05)；给药后3 d，除健康对照组外，各试验组鸡均出现饮水量增加的趋势。给药后5 d，连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组、药物对照组鸡饮水量与模型对照组相比差异显著(P<0.05)，中剂量组鸡饮水量与药物对照组相比差异显著(P<0.05)，高、中剂量组与健康对照组相比无显著差异(P>0.05)(表6)。

表6 连花柴芩可溶性粉对鸡平均饮水量的影响

2.2.2.3 各组鸡体重 给药前，除健康对照组外，由于采食量下降，各试验组鸡体重增长也受到影响。给药后5 d，连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组、药物对照组鸡体重、体增重与模型对照组相比显著提高(P<0.05)，且高、中剂量组鸡体重、体增重显著高于药物对照组(P<0.05)，高剂量组鸡体增重与健康对照组比无显著差异(P>0.05)，连花柴芩可溶性粉高剂量组鸡体重、体增重与中剂量组比无显著差异(P>0.05)(表7)。

表7 连花柴芩可溶性粉对鸡体重的影响

2.2.3 免疫指标

2.2.3.1 各组鸡免疫器官指数 由表8可知，连花柴芩可溶性粉高、中剂量组鸡的胸腺指数显著高于健康对照组(P<0.05)，中剂量组鸡的法氏囊指数显著高于模型对照组和健康对照组(P<0.05)；各试验鸡的脾脏指数无显著差异(P>0.05)。

表8 连花柴芩可溶性粉对鸡免疫器官指数的影响

2.2.3.2 免疫细胞亚群的影响 给药前，与健康对照组相比，各试验组鸡外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞含量均显著降低(P<0.05)；停药后第1天，连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组、药物对照组鸡外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞含量升高，均显著高于模型对照组与健康对照组(P<0.05)，且高、中剂量组CD3+和CD4+T淋巴细胞含量显著高于低剂量组与药物对照组(P<0.05)；停药后第5天，连花柴芩可溶性粉高、中剂量鸡外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞及低剂量组CD4+T细胞含量均显著高于模型对照组与健康对照组(P<0.05)，且高、中剂量组CD4+T细胞含量显著高于低剂量组与药物对照组(P<0.05) (表9)。

表9 连花柴芩可溶性粉对鸡CD3+、CD4+、CD8+ T细胞含量的影响

3 讨 论

目前，关于鸡风热犯肺证模型建立的报道较少，邓锐涵等[20]采用H9N2亚型禽流感病毒(AIV)与脂多糖(LPS)混合感染的方式人工建立鸡风热犯肺证模型并应用于金芩蓝口服液的疗效评价，其病例纳入标准包括主症:发热、咳嗽、甩鼻、咽喉肿胀；次症:眼睛变形结膜充血、腹泻、精神沉郁、食欲减退、扎堆、口渴。与本试验设立的主、次证基本一致，但本试验在明确风热犯肺主、次证的基础上，进一步采用量化分级评分法制定了诊断标准和疗效评价标准，以期能为风热犯肺证中兽药的疗效评价提供参考。

中兽医认为，新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)、IBV、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、流感病毒等均为“疫气”，皆属“热毒”范畴，在气温骤变、季节交替等环境下，风热之毒侵犯肺卫，均易造成鸡的风热犯肺证。本试验药物的抗病毒作用是其用于鸡风热犯肺证的重要基础。连花柴芩可溶性粉由六味中药组成，分别为连翘、山银花、柴胡、黄芩、紫苏叶和甘草。本试验前期设置连花柴芩可溶性粉0.25、0.5、1、2、4、8 g/L 6个不同给药剂量，混饮给药，进行临床用药剂量的筛选，结果表明连花柴芩可溶性粉给药剂量为2.0 g/L时，临床疗效及用药成本综合较佳。因此，本试验以此剂量为基础，设置4、2和1 g/L高、中、低 3个剂量组进行连花柴芩可溶性粉的临床试验。大量研究表明，连翘、山银花有直接抗流感病毒作用[21]，连翘水提液能抑制H5N1和H9N2亚型 AIV在DF-1细胞中的增殖，降低炎症相关细胞因子CX3CL1、IL8L1、CCL5、IL-6和TNF-α的表达[22]，连翘中的主要成分连翘酯苷可显著诱生人工感染IBV雏鸡体内IFN-α的mRNA水平[23]，显著抑制细胞内IBV的复制，提高IBV感染细胞内受体(MDA5、LGP2、NLRC5)和抗病毒基因(IRF7、IFN-α、IFN-β)mRNA的表达[24]，说明连翘有良好的抗炎、抗病毒和解热作用。陈灵等[25]研究表明，山银花水提物具有体外抗甲型H1N1病毒作用，且以治疗给药和直接杀灭给药抗病毒作用较好，金银花和山银花绿原酸类提取物体外均具有显著的抗NDV的作用[26]，这也是试验药物选择连翘、山银花作为主药治疗鸡风热犯肺证的重要基础。此外，连翘酯苷可明显降低副流感病毒感染后家兔的体温[27]，金银花对试验性发热具有明显的解热作用[28]，柴芩水提液对LPS诱导的发热小鼠具有明显的退热作用[29]，这与本试验药物组方中将连翘、山银花、黄芩和柴胡合用可显著降低病鸡体温的结果一致。薛洋等[30]研究了黄芩苷防治鸡传染性支气管炎的药理作用，结果表明，黄芩苷可明显提升病鸡淋巴细胞转化能力，显著提高病鸡CD3+、CD8+T淋巴细胞比率，且使IFN-α浓度长时间维持高水平。与本试验就免疫器官指数和淋巴细胞增殖的结果相吻合。崔小七等[31]用柴黄颗粒防治鸡传染性支气管效果较好，结果表明，在感染前7 d给予2 g/L柴黄颗粒对人工感染鸡传染性支气管炎有较好的保护作用，使其发病率降至50%。本试验结果表明，连花柴芩可溶性粉用于风热犯肺证的临床药效可能与其调节机体免疫系统有关，这也提示有必要开展连花柴芩可溶性粉对鸡风热犯肺证的预防试验，并在现有基础上增加病鸡预后病毒量、炎症因子及相关蛋白等指标评价，对其实际临床应用提供更全面、更科学的数据支撑。

4 结 论

本试验采用IBV攻毒成功复制了鸡风热犯肺证模型，并进行了连花柴芩可溶性粉的临床疗效评价。结果表明，连花柴芩可溶性粉对风热犯肺所致的鸡发热、咳嗽、食欲减退、口渴喜饮具有较好的缓解和治疗效果，结合药物量效关系和经济成本等因素综合考虑，推荐连花柴芩可溶性粉临床应用剂量为2 g/L，饮水给药，连用5 d。