甘草酸对脂多糖应激黄羽肉仔鸡免疫性能的影响

高嘉豪，乔彦杰，连科迅，王蒙蒙，谷新利，邵永斌

(石河子大学动物科技学院，石河子 832003)

在畜禽生产中，免疫应激常导致畜禽机体某些组织器官的结构功能发生病理性变化，造成生长性能和产品品质下降，死亡率升高[1]。陈理盾等[2]研究表明，实际生产中单是疫苗注射引起的免疫应激就能显著影响雏鸡体重，最高时达20%，最低时也有2%。因此在临床生产中，兽医针对畜禽应激，常用到一些抗生素进行处理，但容易使机体产生耐药性，并产生药物残留等诸多弊端，而中草药添加剂具有促进畜禽生长发育﹑调节免疫力等作用[3-4]，因此研制安全有效、天然无抗的中草药添加剂代替抗生素已成为畜牧行业减抗乃至无抗养殖的解决途径之一[5]。

甘草属于豆科植物甘草属，是中医药及中兽医中广泛应用且具有悠久历史的中草药，用药部位主要是根茎部，具有极为丰富的生物学作用。甘草酸(glycyrrhizic acid，GA)是从甘草中分离出的三萜皂苷类活性物质，是甘草提取物中含量最多的化合物，同时也是甘草质量评定的最主要指标之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫调节等药理特性[6-7]。陈璟怡等[8]研究发现，在肉鸡饲粮中添加0.1%甘草提取物可对肉仔鸡的生长起到促进作用，同时可提高其免疫器官指数与疫苗免疫后的抗体效价。邵琦等[9]研究发现，在肉仔鸡饮水中添加50 mg/L甘草霜(粉状甘草粗提物)可增强肉仔鸡免疫作用和抗氧化功能。但是GA作为抗生素替代品用于改善黄羽肉仔鸡免疫性能的研究较少。

本研究使用GA作为饲料添加剂，通过建立黄羽肉仔鸡脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)免疫应激模型并测定血清免疫指标，评价GA免疫调节作用，以期为GA在黄羽肉鸡养殖生产中的应用或深入研究提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

GA(98%)和黄芪多糖(70%)，均购自上海吉至生化科技有限责任公司；LPS(EscherichiacoliO55:B5)购自Sigma公司；鸡免疫球蛋白A(IgA) ELISA试剂盒(批号：202107)、鸡免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒(批号：202107)、鸡免疫球蛋白M(IgM)ELISA试剂盒(批号：202107)、鸡CD4分子ELISA试剂盒(批号：202107)和鸡CD8分子ELISA试剂盒(批号：202107)均购自江苏晶美生物科技有限公司。超净工作台购自苏州净化设备有限公司；Sartorius BS210S电子分析天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；ST16 ST16R高速冷冻离心机购自Thermo公司；多功能酶标仪Biotek SynergeyTM2购自伯腾仪器有限公司；WP25AB恒温培养箱购自上海沪粤明科学仪器公司。

1.2 试验设计与饲粮标准

300只1日龄体重相近的健康快大型黄羽肉仔鸡购自新疆泰昆集团股份有限公司石河子市某孵化厂；基础饲粮为全价配合饲料(乌鲁木齐正大畜牧有限公司)，基础饲粮组成与营养水平见表1。肉仔鸡适应性饲养1周后，随机分为6组，即空白对照组、LPS组、黄芪多糖组(APS)、高剂量GA组(GAH)、中剂量GA组(GAM)和低剂量GA组(GAL)。空白对照组于14、16、18和20日龄10：00～11：00腹腔注射0.9%无菌生理盐水2 mL，其余组注射等体积LPS溶液(1.5 mg/kg BW)建立体内免疫应激模型。空白对照组和LPS组饲喂基础饲粮，APS组、GAH组、GAM组和GAL组于应激模型建立阶段及前后3天(即11～23 d)分别在基础饲粮中添加400 mg/kg APS和120、100、80 mg/kg GA。试验期49 d。

表1 基础饲粮组成与营养水平(风干基础)

续表

1.3 饲养管理

肉仔鸡采用室内网上平养方式，鸡舍用具于入鸡前3周彻底打扫冲洗，采用固体甲醛熏蒸消毒1周，通风。入鸡前24 h内使用控制器将鸡舍温度保持在32～35 ℃，入鸡后温度不变且24 h光照维持1周，之后温度每周下降2～3 ℃，最后控制在20～22 ℃，每天光照23 h。所有试验鸡用常规免疫程序免疫，自由采食和饮水，其他饲养管理方式均一致。

1.4 指标测定

分别于试验鸡第21、28、35、42、49日龄，每组随机选取10只鸡，每个重复2只，翅静脉采血5 mL/只，采集的血液在常温下倾斜静置2 h，再3 000 r/min离心10 min，收集血清，—20 ℃保存备用。最后按照ELISA试剂盒说明书测定免疫细胞CD4、CD8和免疫活性物质IgA、IgG、IgM含量。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，对差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 GA对肉仔鸡血清CD4分子含量的影响

由表2可知，21～49日龄时，与空白对照组相比，其余5组肉仔鸡血清CD4分子含量均极显著下降(P<0.01)，尤其是LPS组，下降幅度最大。与LPS组相比，APS组和3个GA组肉仔鸡血清CD4分子含量均有所升高，其中GAH组的升高幅度与APS组最接近，且均极显著或显著高于LPS组(P<0.01；P<0.05)；在3个GA组间，肉仔鸡血清CD4分子含量均随GA添加量增加而升高，尤其是在42日龄时，GAH组与APS组间差异不显著(P>0.05)。

表2 肉仔鸡血清CD4分子含量检测结果

2.2 GA对肉仔鸡血清CD8分子含量的影响

由表3可知，21～49日龄时，与空白对照组相比，其余5组肉仔鸡血清CD8分子含量均有所升高，尤其是LPS组升高幅度最大，且极显著高于空白对照组(P<0.01)；与LPS组相比，APS组和3个GA组肉仔鸡血清CD8分子含量均极显著或显著降低(P<0.01；P<0.05)，其中GAH组的降低幅度与APS组最接近，且两组间无显著差异(P>0.05)；在35和49日龄时，GAH组肉仔鸡CD8分子含量与空白对照组差异不显著(P>0.05)。

表3 肉仔鸡血清CD8分子含量的检测结果

2.3 GA对肉仔鸡血清IgA含量的影响

由表4可知，21～49日龄时，与空白对照组相比，其余5组肉仔鸡血清IgA含量均有所升高，尤其是LPS组升高幅度最大，且极显著高于空白对照组(P<0.01)；与LPS组相比，APS组和3个GA组肉仔鸡血清IgA含量均极显著降低(P<0.01)，且3个GA组随GA添加量增加肉仔鸡血清IgA含量呈降低趋势，其中GAH组的降低幅度与APS组最接近，除35日龄外，其他日龄时两组间均无显著差异(P>0.05)；在21和49日龄时，GAH组与空白对照组差异均不显著(P>0.05)。

表4 肉仔鸡血清IgA含量的检测结果

2.4 GA对肉仔鸡血清IgG含量的影响

由表5可知，21～49日龄时，与空白对照组相比，其余5组肉仔鸡血清IgG含量均有所升高，尤其是LPS组升高幅度最大，且极显著高于空白对照组(P<0.01)；与LPS组相比，APS组和3个GA组肉仔鸡血清IgG含量均极显著降低(P<0.01)，且3个GA组随GA添加量增加肉仔鸡血清IgG含量呈降低趋势，其中GAH组的降低幅度与APS组最接近，除28日龄外，其他日龄时两组间均无显著差异(P>0.05)；在35日龄时，GAH组与空白对照组差异不显著(P>0.05)。

表5 肉仔鸡血清IgG含量的检测结果

2.5 GA对肉仔鸡血清IgM含量的影响

由表6可知，21～49日龄时，与空白对照组相比，LPS组、GAL组和GAM组肉仔鸡血清IgM含量极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，APS组和3个GA组肉仔鸡血清IgM含量均极显著降低(P<0.01)，且3个GA组随GA添加量增加肉仔鸡血清IgM含量呈降低趋势，其中GAH组的降低幅度与APS组最接近，除42日龄外，其他日龄时两组间均无显著差异(P>0.05)；在21日龄时，GAH组与空白对照组差异不显著(P>0.05)。

表6 肉仔鸡血清IgM含量的检测结果

3 讨 论

CD4分子主要由辅助性T淋巴细胞(Th1、Th2)表达，在MHCⅡ分子进行抗原递呈时，可参与T细胞对抗原的识别、信号传递等,同时促进T细胞活化，因此CD4分子与细胞免疫关联密切[10]。CD8分子主要由细胞毒性T淋巴细胞表达,通过MHCⅠ等多种途径对识别抗原、裂解靶细胞具有重要作用[11]。LPS是目前较为常用的免疫应激模型的造模剂[12-13],尤其在建立肉仔鸡的免疫应激模型时，效果较好[14-15]，能够诱导动物机体中枢和外周细胞因子的升高和多种炎性细胞因子的分泌。Wang等[7]试验结果表明，GA能够通过核因子κB(NF-κB)和JNK信号通路激活鸡的巨噬细胞系统，提高细胞免疫因子等的表达水平。王元元等[16]研究表明，GA可对小鼠的免疫功能进行调节。此外，GA与肾上腺皮质激素的结构相似，功能相近，对于糖皮质激素受体(GR)同时具有激动和颉颃作用[17]。杨思雨[18]研究发现，复方甘草酸苷治疗儿童肺炎后，CD4+、CD8+细胞水平降低、CD4+/CD8+细胞水平升高并接近正常。洪安林[19]研究发现，紫外线光疗联合复方甘草酸铵加消银颗粒治疗银屑病时CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群水平高于对照组。郭凡溪[20]研究发现，复方甘草酸单胺粉可缓解因LPS联合恩诺沙星的炎症模型中鸡外周血T细胞亚群紊乱。本试验结果显示，LPS诱导的黄羽肉仔鸡体内免疫应激模型效果良好，对血清CD4分子含量降低和CD8分子含量的升高作用极显著；而GA各组对缓解以上现象均有较好效果，说明GA同其相关物如甘草酸苷、甘草酸单胺、复方甘草酸铵等在T淋巴细胞参与的免疫方面具有相似作用；与具有增强免疫作用的APS组相比较，GAH组CD8和CD4分子含量与APS组接近，可见其免疫调节作用较好，且存在剂量效应。此外，CD4分子含量随时间的动态变化方面表现为各组总体上均在28与42日龄呈现下降趋势，其原因可能是28日龄时药效的作用还未达到峰值，而42日龄时药效的作用已经不明显；CD8分子含量随时间的动态变化方面表现为各组总体上均在35日龄呈现下降趋势，可能此时应激损伤的强度最大，但其机制有待进一步研究。

免疫球蛋白广泛分布在动物机体内环境和分泌物中，结构与抗体相似，具有免疫活性。Yang等[21]研究发现，LPS刺激肉仔鸡后其血清IgG含量明显升高。李国军[22]研究发现，LPS造成的免疫应激可显著升高黄羽肉鸡的血清IgG和IgM含量。李昆[23]研究发现，肉仔鸡注射LPS后引起了肉仔鸡的免疫系统过度活化，从而使体液免疫中血清IgA和IgG的含量明显升高。丁艳[24]研究发现，对京红1号蛋雏鸡腹腔注射LPS后其血清中IgG、IgA以及CD4的含量显著提高。毛予龙[25]研究发现，甘草酸苷可显著上调小鼠回肠中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)以及血清白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、IL-12与γ干扰素(IFN-γ)的含量，增强免疫功能。朱万刚等[26]研究发现，甘草浸膏粉能显著提高猪瘟疫苗免疫后断乳仔猪的猪瘟病毒抗体(CSFV-Ab)、IgM、IgA、IgG含量，同时可以降低料重比，提高仔猪免疫力，增加断奶后仔猪外周血中的红细胞数量。司常云[27]研究发现，α体GA制剂在治疗自身免疫性肝炎的过程中，患者高于正常指标的IgG、C反应蛋白、γ-球蛋白等显著下降。本试验结果显示，LPS诱导的黄羽肉仔鸡体内免疫应激模型在血清IgA、IgG、IgM升高方面效果良好，与李昆[23]和丁艳[24]的研究结果一致，而GA各组对缓解以上现象均有较好效果，说明GA同甘草酸苷、甘草浸膏粉及部分GA制剂具有相似作用。与公认具有增强免疫作用的APS组相比，3个浓度的GA在缓解LPS刺激引起的黄羽肉仔鸡血清IgA、IgG、IgM升高方面均具有极显著的效果，其中GAH组IgA、IgG和IgM含量与APS组接近，可见其免疫调节效果好。但GA在肉仔鸡中应用的最佳剂量和作用机制仍有待进一步研究。

综上所述，GA具有较好的免疫增强效果，其具有多种药理作用，与传统免疫增强药物APS的效果相近时剂量却远低于APS，可见其具有较大研究意义，本课题组率先研究了GA对黄羽肉仔鸡的免疫作用，丰富了GA作为畜禽添加剂应用的理论依据。

4 结 论

本试验表明，肉仔鸡饲粮中添加80、100和120 mg/kg BW GA时可缓解LPS造成的免疫系统过度活化引起的血清IgA、IgG、IgM异常升高现象，从而发挥免疫调节作用，且其免疫调节能力有剂量效应。