两种有机锌源对新生犊牛生长性能及锌代谢的影响

沃野千里，高 铎，马峰涛，金宇航，刘 茁，孙 鹏

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，石家庄 050000)

锌是满足犊牛生长的必需微量元素，几乎所有基本的生命活动(细胞增殖和分化[1]、DNA修饰[2]、ATP酶活性[3]和糖脂代谢[4]等)所需的蛋白质和酶都直接或间接依赖锌元素的参与，因此锌元素也被誉为“生命之花”。新生时期的犊牛处于生长发育的关键阶段，此时机体的生长发育亟需锌的参与[5]。在缺锌状态下，犊牛会表现出生长缓慢、骨骼发育不良、精神顿郁和食欲减退等症状[6]，并且可能导致腹泻和呼吸道疾病[7]，严重影响犊牛健康，间接提高奶牛的淘汰率，造成巨大的经济损失。在通常情况下，牛乳中的锌元素能够基本满足犊牛生长发育和代谢的需要，然而除了从牛乳中摄取的锌以外，在饲粮中额外添加适宜水平的锌能够改善犊牛锌代谢水平，有利于增强犊牛抗氧化机能，降低腹泻率[8-9]。

由于锌具有改善畜禽生长性能、抗菌、抗炎、抗应激和增强免疫力等功能[10-11]，锌元素已被广泛应用为饲料添加剂。锌添加剂主要分为无机锌添加剂和有机锌添加剂两大类，无机锌添加剂主要有传统的氧化锌，以及新型的纳米氧化锌和多孔氧化锌等[12-13]。有机锌添加剂主要是锌离子和有机螯合体(蛋白质、氨基酸和小肽等)通过共价键形成的螯合物，主要有氨基酸螯合锌、蛋白锌和酵母锌等[14]。

传统无机锌的生物利用率较低，饲喂动物会导致粪尿中排放的锌含量升高，造成环境污染，因此，2017年颁布的农业农村部公告第2625号《饲料添加剂安全使用规范》禁止了饲粮中高剂量氧化锌的使用。有机锌源是一类新型、高效的锌添加剂。蛋白锌主要是由锌离子与分离的大豆蛋白螯合产生的一种锌蛋白盐[15]。蛋白锌的制备工艺简单，原料和生产成本相对较低，目前多用水体系合成法来生产，有助于克服传统无机锌源生物利用率低、疏水性高和破坏饲料营养成分等缺点，且其成本通常低于蛋氨酸锌，是一种有前景的饲料添加剂[16]。蛋氨酸锌是蛋氨酸和无机锌通过酸碱中和法在一定的温度和压力下生成的有机螯合锌[17]，蛋氨酸锌是一种高效的自由基清除剂，能够缓解脂质过氧化、谷胱甘肽消耗和DNA片段化等氧化应激造成的损伤[18]，其应用在饲粮中能够提高生长性能，改善免疫功能，降低腹泻率[19]。与传统的氧化锌相比，有机锌生物利用率更高，具有高稳定性、易吸收等优势，能够降低锌元素添加过量造成的环境污染[20-21]。前人的研究表明，在新生犊牛饲粮中添加有机锌源，能够提高犊牛日增重和饲料转化率，降低腹泻率和改善肠道屏障功能[22]，对于改善新生犊牛健康具有重要意义。

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所家畜营养与调控科技创新团队的前期研究表明，在新生犊牛饲粮中添加锌元素的最适剂量为80 mg/d[9]，并且与氧化锌相比，蛋白锌和蛋氨酸锌均具有更高的生物利用率[23-24]，但是目前不同有机锌源对新生犊牛的促生长效果和锌吸收效率仍有待研究。因此，本试验在新生犊牛饲粮中分别以蛋白锌和蛋氨酸锌的形式添加80 mg Zn/d，测定其对1～14日龄犊牛生长性能和腹泻率、血清矿物元素和锌代谢指标的影响，旨在比较不同有机锌源对新生犊牛早期生长性能和腹泻率及机体锌代谢的影响，筛选更加有效的有机锌源，为其在犊牛饲养中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2020年10月至2020年11月在河北省邢台市君兴牧业有限公司开展。

1.2 材料

蛋氨酸锌购自北京市某生物科技有限公司，纯度≥95.00%；蛋白锌[螯合强度(Qf)为357，锌含量为15.30%]由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所矿物元素研究室馈赠。

1.3 试验动物与分组

根据体重、胎次相近原则，选取30头新生荷斯坦母犊牛(体重39.4 kg±0.8 kg)，随机分成3个处理组，每组10个重复，每重复1头牛。对照组(CON)只饲喂牛乳，不添加有机锌源添加剂；蛋白锌组(Zn-Pro)在饲喂牛乳的基础上，每头牛额外饲喂522.82 mg/d的蛋白锌(相当于80 mg Zn/d)；蛋氨酸锌组(Zn-Met)在饲喂牛乳的基础上，每头牛额外饲喂467.88 mg/d的蛋氨酸锌(相当于80 mg Zn/d)。

1.4 饲粮与犊牛饲养管理

在每头犊牛出生后，立即将其从母牛分娩舍中取出，放入犊牛岛单栏饲养。所有犊牛在出生后1 h内灌胃4 L初乳。1～14日龄期间，每头犊牛每天饲喂2次常乳(08：00、20：00)，每次4 L，每天共8 L，试验期间不饲喂犊牛开食料。在饲喂不同锌源添加剂时，首先将蛋白锌或蛋氨酸锌与200 mL牛乳混合后饲喂给犊牛，待完全采食之后，再继续将牛乳饲喂给犊牛，每日计算牛奶采食量。采用乳成分分析仪(MilkoScanTMFT-6000)测定牛乳的密度、蛋白质、脂肪、乳糖和总固形物含量(表1)。试验从犊牛生后1日龄起，至14日龄结束，试验期14 d。

表1 乳成分

1.5 样品采集与指标测定

1.5.1 生长性能和腹泻率测定 每头犊牛在1、14日龄晨饲前，测量体重，并计算平均日增重(average daily gain，ADG)。根据牛乳采食量，计算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比。每天晨饲前，由专人观察犊牛粪便形态，进行粪便评分，评分标准参考Ma[23]等研究：粪便正常，呈圆柱形记1分；粪便成型，但轻微稀软记2分；粪便液状不成型，但颜色正常(黄色)记3分；粪便水分含量高，颜色不正常(绿色、红色)记4分。粪便指数为3、4分的犊牛记为腹泻，试验结束后，统计总腹泻犊牛数和腹泻天数，根据公式计算腹泻率：腹泻率(%)=[总腹泻头数×腹泻天数/(试验犊牛数×总试验天数)]×100。

1.5.2 血清样品采集 每头犊牛在14日龄晨饲前，使用真空采血管于颈静脉穿刺获得血样，将血样放入高速冷冻离心机(Eppendorf 5810R)，在4 ℃下以3 000×g离心15 min，收集血清并储存于-80 ℃以备测定。

1.5.3 矿物元素浓度 根据中国国家标准(GB 5009.268—2016)所述，采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定血清中的钙、磷、锌、铜和铁浓度。

1.5.4 血清锌代谢指标 血清中的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性，以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)浓度，均使用商业试剂盒检测(南京建成生物工程研究所)。血清中的金属硫蛋白(metallothionein，MT)浓度采用ELISA试剂盒测定(武汉基因美生物科技有限公司)。上述所有试验操作均按照试剂盒说明书进行。

1.6 数据分析

用Excel 2010对试验数据进行初步处理，腹泻率采用卡方检验进行分析，使用SAS 9.4软件对生长性能、血清矿物元素和锌代谢指标的数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，采用Tukey法进行多重比较，数据以最小二乘均值和标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 不同有机锌源对荷斯坦犊牛生长性能和腹泻率的影响

如表2所示，与对照组相比，饲粮中添加蛋氨酸锌显著提高了犊牛的ADG(P<0.05)；蛋白锌组犊牛的ADG与对照组和蛋氨酸锌组相比差异均不显著(P>0.05)。两种有机锌源对犊牛平均日采食量和料重比均无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，蛋白锌和蛋氨酸锌组犊牛1～14 d腹泻率均显著降低(P<0.05)。

表2 各组荷斯坦犊牛生长性能和腹泻率

2.2 不同有机锌源对荷斯坦犊牛血清矿物元素的影响

如表3所示，与对照组相比，添加蛋白锌和蛋氨酸锌均能显著提高犊牛血清中的锌浓度(P<0.05)，且蛋氨酸锌组犊牛血清中的锌浓度显著高于蛋白锌组(P<0.05)。蛋白锌组犊牛血清中的铜浓度与对照组相比无显著差异(P>0.05)。与对照组和蛋白锌组相比，蛋氨酸锌组犊牛血清中的铜浓度显著降低(P<0.05)。不同有机锌源对犊牛血清中的钙、磷和铁浓度均无显著影响(P>0.05)。

表3 各组荷斯坦犊牛血清矿物元素浓度

2.3 不同有机锌源对荷斯坦犊牛血清锌代谢指标的影响

如表4所示，与对照组相比，饲粮中添加蛋白锌对犊牛血清中ALP活性、SOD活性和T-AOC均无显著影响(P>0.05)，但能够显著增加血清中MT浓度(P<0.05)，降低血清中MDA浓度(P<0.05)；添加蛋氨酸锌显著提高了犊牛血清中ALP活性、MT浓度、SOD活性和T-AOC(P<0.05)，显著降低了血清中的MDA浓度(P<0.05)。

表4 各组荷斯坦犊牛血清锌代谢指标测定结果

3 讨 论

3.1 不同有机锌源对荷斯坦犊牛生长性能和腹泻率的影响

新生时期的犊牛处于生长发育的重要阶段，此阶段犊牛生长性能良好对于发挥奶牛泌乳潜能具有积极意义[25]。新生时期犊牛的免疫功能较为脆弱，特别是在出生后前2周，犊牛血液中的免疫球蛋白含量逐渐降低，容易发生生长迟缓及腹泻等问题[26]。由于围产期奶牛饲粮中含锌，新生犊牛的缺锌状况较少，然而，在饲粮中补充锌能够缓解新生犊牛腹泻[9,19]，因此，有必要在1～14日龄犊牛饲粮中额外添加适当水平的锌以促进犊牛生长，降低腹泻率。

ADG是衡量新生犊牛生长性能最重要的指标之一。已有研究表明，饲粮中以蛋白锌形式添加80 mg Zn/d能够提高犊牛生长性能，且其效果与添加180 mg Zn/d的氧化锌相当[24]。犊牛饲粮中添加锌含量为80 mg/d的蛋氨酸锌能够提高犊牛8～14日龄的ADG，降低料重比，且其生物利用率高于氧化锌[23]；Chang等[19]研究表明，蛋氨酸锌能够提高1～14日龄犊牛的ADG。本试验结果表明，添加蛋氨酸锌提高了1～14日龄犊牛ADG，与上述研究结果一致。

犊牛的饲粮、免疫以及饲养管理等因素均可能引发腹泻，导致犊牛采食量下降、生长迟缓，并且降低奶牛未来的产奶性能[27]。饲粮中添加不同剂量的氧化锌能够线性降低1～14日龄犊牛腹泻率[9]。与氧化锌的效果类似，饲喂有机锌能够降低畜禽的腹泻率，Glover等[28]表明，在腹泻期间犊牛体重减轻了67 g/d，而饲喂蛋氨酸锌的腹泻犊牛体重增加了40 g/d。Feldmann等[8]研究表明，与对照组相比，蛋氨酸锌组犊牛腹泻率降低14.7%。在犊牛饲粮中添加不同剂量的蛋白锌能够降低犊牛粪便指数，且其效果与添加高剂量氧化锌相当[24]。与上述研究结果一致，本试验结果表明，添加蛋白锌和蛋氨酸锌均显著降低了犊牛腹泻率。这可能与有机锌源提高肠道黏膜绒毛长度及紧密连接蛋白表达量有关，Ma等[22]发现蛋氨酸锌能够显著降低1～14日龄犊牛D-乳酸含量，提高空肠黏膜绒毛长度，并且提高连接蛋白(claudin)、闭锁蛋白(occludin)和闭锁连接蛋白-1(ZO-1)的mRNA表达，且其效果优于氧化锌。

本试验中蛋氨酸锌改善生长性能的效果优于蛋白锌，这可能是由于蛋氨酸锌组犊牛的平均腹泻率低于蛋白锌组，且蛋氨酸锌具有良好的化学稳定性及较高的生物利用率，更加适合犊牛吸收，同时蛋氨酸是满足生长所需的必需氨基酸之一，本身具有潜在的促生长作用[29]，蛋氨酸与锌螯合后可能更加有利于锌的吸收，从而产生更好的促生长功效。

3.2 不同有机锌源对荷斯坦犊牛血清中矿物元素的影响

由于畜禽自身无法合成锌元素，因此所需锌只能通过饲粮摄取。有机锌能够提高消化系统对锌的吸收和转运能力，与无机锌相比，有机锌在细胞膜上具有更高的溶解速率和通过率，有机配体能够保护Zn2+免受植酸、单宁和棉酚等物质的结合，并且有机锌能够通过氨基酸转运途径吸收进入细胞，避免金属离子之间的吸收颉颃[30]，因此，有机锌源比无机形式具有更高的生物利用率[26]。Kincaid等[31]发现，在犊牛饲粮中添加有机锌(蛋氨酸锌、赖氨酸锌等)能够提高犊牛肝脏中的锌含量。金宇航等[24]研究表明，犊牛饲粮中添加蛋白锌(>80 mg Zn/d)能够显著提高14日龄犊牛血浆中的锌含量，而在饲粮中添加蛋氨酸锌能够提高14日龄犊牛血清和肝脏中锌的含量[32]。与上述结果一致，本试验结果表明，蛋氨酸锌和蛋白锌均能显著提高血清中锌浓度，且蛋氨酸锌组高于蛋白锌组。蛋白锌相对略低的吸收率可能与其螯合强度有关。Huang等[33]发现，蛋白锌的生物利用度与其Qf密切相关。本研究中使用的蛋白锌的Qf=357，低于Huang等[33]采用的蛋白锌的Qf(944)。因此，需要进一步研究不同Qf的蛋白锌对犊牛锌吸收效率的影响。另外，当摄入的锌、铜元素在抵达小肠绒毛刷状缘时，可能会相互竞争吸收载体和结合位点，导致锌铜颉颃吸收[34]，因此当机体锌水平过高时容易导致低铜血症，出现生长缓慢和骨骼发育不良等症状。但在本试验中，蛋白锌组在显著提高锌浓度的同时，其血清中铜浓度也显著高于蛋氨酸锌组和对照组。推测补充蛋白锌有助于缓解锌和铜之间的颉颃关系，在提高血清中锌浓度的同时避免血清铜浓度过度下降。Ao等[15]的研究结果也同样表明，蛋白锌有利于提高十二指肠黏膜中的铜浓度，从而缓解锌和铜之间的颉颃作用。在本试验中添加有机锌源未影响血清中钙、磷和铁的浓度，与前人研究结果[35]一致。

3.3 不同有机锌源对荷斯坦犊牛血清锌代谢指标的影响

锌是维持锌依赖酶和锌结合蛋白结构的关键因子，这些酶和蛋白在机体锌代谢中扮演重要角色。为进一步研究有机锌源对新生犊牛锌代谢的影响，本试验检测了犊牛血清中的锌依赖酶与锌结合蛋白的含量。ALP是一种含锌的磷酸酶，能够去除核酸和蛋白质等大分子上的磷酸基团产生羟基和磷酸根离子，ALP的活性常被用于反映机体的锌水平[36]。已知添加锌元素能够增加犊牛血清中ALP活性[37]，在犊牛饲粮中添加蛋氨酸锌能够提高14日龄犊牛血清中ALP活性[23]。在本试验中蛋氨酸锌显著提高了血清ALP活性，结果与上述试验一致。MT是一种具有高亲和力的锌铜结合肽，其分泌受到锌水平调控，是维持细胞内锌浓度的缓冲物质，MT也是能够反映锌水平的生物标志物[38]。研究证明，犊牛饲粮中添加锌可以提高其肝脏中的MT浓度[39]，而添加蛋氨酸锌能够增加血清中MT浓度[23]。本试验结果表明，添加有机锌均可提高犊牛血清中MT浓度，这一结果与上述研究一致。另外，MT不仅可以作为反映锌水平的生物标志物，还能够充当机体的抗氧化物[38]，有研究表明MT的抗氧化活性高于SOD和谷胱甘肽过氧化物酶[40]。饲粮中添加蛋氨酸锌增加了犊牛血清MT浓度[24]，因此MT浓度上升可能与蛋氨酸锌提高了血清抗氧化性能有关。

SOD是一种含锌的抗氧化金属酶，对于清除自由基具有显著效果，但其活性受到机体锌水平的调控，因为SOD的活性中心含有锌离子，锌起到稳定活性中心的作用。有研究证明，犊牛血清中SOD活性随锌添加剂量的提高线性升高[9]。Dresler等[32]研究表明，饲粮中添加蛋氨酸锌能够增强机体的抗氧化能力，提高断奶犊牛血清中SOD活性。另外，Chen等[41]试验表明，饲粮中添加蛋氨酸锌能够提高奶牛血清中T-AOC的含量。在本研究中，蛋氨酸锌同时提高了犊牛血清中SOD活性及T-AOC浓度，与前人研究结果一致，表明蛋氨酸锌有利于提高犊牛机体的抗氧化能力。活性氧是细胞代谢产生的超氧阴离子自由基，当活性氧的生成超过自身抗氧化能力时，就会引发氧化应激[42]，其中MDA是氧化应激状态下脂质过氧化产物，因此常被用于评价机体的氧化应激状态。研究表明，犊牛血清中MDA含量随饲粮中锌添加量的增加而线性降低[9]，Alimohamady等[43]研究表明添加蛋白锌和蛋氨酸锌可降低反刍动物血清中MDA浓度。在本试验中，添加蛋白锌和蛋氨酸锌降低血清MDA浓度，以上结果表明，犊牛日粮中补充有机锌源有利于提高机体的抗氧化能力，其机制可能是锌通过调节Nrf2信号通路从而增强抗氧化酶基因表达[44]，有待于进一步探究。

4 结 论

饲粮中以蛋氨酸锌的形式添加80 mg Zn/d显著提高了1～14日龄犊牛的平均日增重；两种有机锌均能提高犊牛血清中的锌浓度，降低犊牛腹泻率，均有利于改善犊牛血清中的锌代谢相关指标。本试验条件下，蛋氨酸锌的作用效果优于蛋白锌，但蛋白锌生产成本更低，更有利于推广应用。