小鼠感染BVDV诱导NLRP3炎症小体的表达及其对病毒复制的影响

刘思雨 张月莹 黄 江 崔月琦 刘 宇，2 周玉龙，2 朱战波，2* 张泽财，2*

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆，163319；2.黑龙江省牛病防控工程技术研究中心，黑龙江 大庆，163319)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛胃肠道、呼吸道和生殖疾病的重要病原体，它所引起的疫病呈世界性分布，给养牛业造成了持续的经济损失[1-2]。BVDV可以引起宿主动物的免疫抑制和持续性感染，从而促进牛群中BVDV的循环。BVDV进化出了多种策略来逃避宿主的先天性免疫[3-4]。

已有研究表明BVDV感染的BALB/c小鼠在第14天时仍可在体内检测到病毒[5]。同时，Lee等[6]研究发现，BVDV感染的BALB/c小鼠脾脏出现明显的病理组织学变化，骨髓中巨核细胞数量也明显增加。另外，2016年，Choi等[7]研究也证实BVDV感染的BALB/c小鼠在第9天时仍可以在脾脏和肠系膜淋巴结中检测到病毒抗原。近期研究也证实BVDV感染的BALB/c小鼠在第7天时出现明显的病毒血症[8]。此外，本研究团队前期研究显示，致细胞病变(CP)型和非致细胞病变(NCP)型BVDV感染的小鼠均呈现白细胞、淋巴细胞和血小板的减少，以及病毒血症[9]，表明BALB/c小鼠可以作为感染模型用于BVDV致病机制的研究。

先天性免疫是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，在抗感染免疫中发挥关键的作用。研究证实，宿主先天性免疫受体可通过识别入侵的BVDV粒子，进而启动一系列免疫反应，发挥抗病毒效果。NLRP3炎症小体是先天性免疫中重要模式识别受体，是由NLRP3受体、适配器ASC和Caspase-1组成的寡聚复合体。组装后的NLRP3炎症小体将会触发pro-Caspase-1自切割为成熟的Caspase-1，随后，介导IL-1β的分泌，对宿主抵御微生物至关重要[10]。越来越多的研究证实，NLRP3炎症小体参与多种病毒的致病机制，如猪繁殖与呼吸综合征病毒，呼吸道合胞病毒和猪瘟病毒等[11-13]。然而BVDV体内感染后NLRP3炎症小体的活化规律，国内外尚未见报道。本研究拟探究BVDV感染后诱导NLRP3炎症小体激活的规律，以及NLRP3炎症小体激活与病毒复制的相关性，为BVDV拮抗宿主先天性免疫的机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病毒株和实验动物

BVDV标准株NADL(CP型)由黑龙江省牛病防控工程技术研究中心保存。4～6周龄雌性的SPF级BALB/c小鼠购自哈尔滨医科大学实验动物医学部。

1.2 主要试剂

兔源NLRP3单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔源Caspase-1和IL-1β单克隆抗体购自安诺伦生物技术有限公司；山羊抗兔IgG/辣根酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；逆转录试剂盒、SYBR荧光定量qRT-PCR试剂盒购自Takara公司。

1.3 动物分组和处理

将BALB/c小鼠在隔离器中预饲喂适应一周后，随机分成8组，即1个对照组和7个攻毒组，每组各5只。攻毒组每只腹腔注射105TCID50的CP型BVDV，对照组注射等量的PBS，小鼠自由采食和饮水。在攻毒后的不同时间点(0、6、12、24、48、96、168和240 h)分别采集小鼠的十二指肠、脾脏和血液。所有试验均获得黑龙江八一农垦大学动物伦理委员会批准。

1.4 荧光定量PCR检测NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA表达

无菌取攻毒后不同时间点小鼠的十二指肠进行研磨，提取总核糖核苷酸(RNA)，通过逆转录反应合成互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)，以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应；β-actin为内参。引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Real-time PCR

反应条件：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，水9.5 μL，上下游引物各1 μL，目的模板1 μL共25 μL体系在95 ℃预变性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s条件下共40个循环。SteponePlus软件测定其Ct值，将正常对照组设定为1，采用2-ΔΔCt法分析进行mRNA表达水平，ΔΔCt=试验组(Ct目的基因-Ct内参基因)-空白组(Ct目的基因-Ct内参基因)。

1.5 Western Blot分析NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达

取攻毒后24 h和168 h(7天)小鼠十二指肠，加入细胞裂解液，提取蛋白。取30 μg样品进行80 V恒压电泳40 min，然后120 V恒压电泳45 min，切下目的蛋白凝胶并转印至PVDF膜，5%的脱脂乳封闭2 h后分别加入一抗为兔源的NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)的单克隆抗体和兔源的Tubulin(1∶5 000)的单克隆抗体4 ℃过夜。加入1∶8 000稀释的山羊抗兔的二抗后，37 ℃孵育1 h，使用ECL显色剂对膜进行显色，于凝胶成像仪中进行曝光成像，得到灰度值，计算相对表达量。

1.6 荧光定量PCR检测小鼠十二指肠、脾脏和血液的病毒载量

取攻毒后不同时间点小鼠的十二指肠、脾脏进行研磨并将小鼠眼球采集抗凝血，提取总RNA通过逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模版，进行荧光定量PCR反应。BVDV引物序列，上游为：5′-GAGTACAGGGTAGTCGTCAG-3′，下游为5′-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3′，扩增长度130 bp。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共35个循环，根据标准曲线Y=-2.909 4X-40.812计算出病毒载量。

1.7 十二指肠和脾脏病理组织学检查

在病毒感染第7天时，无菌采取对照组和感染组的十二指肠和脾脏，将其在4%的多聚甲醛中固定一周后经冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、苏木素-伊红染色、封片等步骤，制作组织切片并观察。

1.8 统计分析

2 结果与分析

2.1 BVDV感染小鼠体内NLRP3、Caspase-1和IL-1β基因表达情况

qRT-PCR结果表明，小鼠感染BVDV后十二指肠中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达量从第12 h开始逐步升高，24 h时达到高峰(P<0.05)；在感染第48 h和96 h(4 d)时，其基因表达与对照组相比并无明显的变化(P>0.05)；但在感染第168 h(7 d)时，其表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)，感染第240 h(10 d)时略有升高但仍低于对照组(图1)。

图1 qRT-PCR检测BVDV感染早期小鼠十二指肠NLRP3(a)、Caspase-1(b)和IL-1β(c)的mRNA表达水平Fig.1 Relative mRNA levels of NLRP3 (a), Caspase-1 (b) and IL-1β (c) by qRT-PCR in the early stage of BVDV infection

2.2 BVDV感染小鼠体内NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达情况

由图2可知，Western Blot检测发现腹腔注射BVDV的小鼠在24 h时，小鼠十二指肠中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平与对照组相比显著升高(P<0.05)。由图3可知,其变化趋势与mRNA表达水平的结果相一致；当BVDV感染第168 h(7 d)时，小鼠十二指肠中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平与对照组相比显著降低(P<0.05)。此变化趋势与mRNA表达水平的结果相一致。上述结果表明BVDV感染早期，小鼠体内的NLRP3-(Caspase-1)/IL-1β信号通路被激活，感染第168 h(7 d)时，NLRP3炎症小体活化被抑制。

1和2分别代表各组中2个不同小鼠的十二指肠样本。1 and 2 represent duodenal samples from 2 different mice in each group.

1和2分别代表各组中2个不同小鼠的十二指肠样本。1 and 2 represent duodenal samples from 2 different mice in each group.

2.3 小鼠体内病毒含量的检测

qRT-PCR结果表明，BVDV感染早期的小鼠十二指肠和脾脏中病毒载量逐渐升高。在感染的168 h(7 d)十二指肠、脾脏和血液中病毒载量均达到高峰(图4)。

图4 小鼠十二指肠(a)、脾脏(b)和血液(c)病毒载量Fig.4 Viral load in the duodena (a), spleen (b) and blood (c) of all infected mice

2.4 小鼠十二指肠、脾脏病理组织学变化

与空白对照组小鼠相比较，BVDV感染后第7天小鼠十二指肠呈现为肠腺上皮大量坏死，基层变厚并且有较多的炎性细胞浸润；脾脏可见淋巴细胞变性、坏死，间质疏松和水肿(图5)。

(a)小鼠十二指肠对照组与感染组；(b)小鼠脾脏对照组与感染组

3 讨 论

NLRP3炎症小体是目前研究最多的NLR家族成员[14]，炎症小体的活化包含2个步骤：首先，宿主细胞对微生物的模式识别诱导了pro-IL-1β和NLRP3的转录[15]；其次，危险信号激活炎症小体，导致Caspase-1的活化，并将细胞因子前体切割为成熟的具有生物活性的IL-1β和IL-18，以及触发细胞焦亡[16-17]。IL-1β作为炎症反应上游的细胞因子，能够促进炎症反应并起到清除病原体的作用[18-19]。本研究发现，与空白对照组相比，小鼠感染BVDV早期NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平随时间推移逐步升高，在感染后24 h的mRNA和蛋白的表达水平均显著高于对照组，表明BVDV感染早期可以导致小鼠体内NLRP3炎性小体激活。

NLRP3炎症小体在许多抗病毒免疫中被激活，然而，研究表明NLRP3炎症小体的活化在不同病毒致病机制中发挥的作用可能存在差异。Cui等[20]研究证实，ZIKV感染可以通过介导NLRP3炎症小体激活促进cGAS的降解，进而抑制Ⅰ型干扰素的产生，导致ZIKV逃避宿主抗病毒反应。另外，有研究表明，丙型肝炎病毒具有抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体活化的作用[21]。近期研究也证实，甲型流感病毒感染小鼠1周时，NLRP3和Caspase-1的表达比感染早期进一步升高，IL-1β的转录和分泌也进一步增强，促进了甲型流感病毒感染[22-23]。本研究中，与许多前期研究结果相似的是，在BVDV感染早期，NLRP3炎症小体被激活，然而在BVDV感染小鼠的第7天，发现NLRP3、Caspase-1和IL-1β基因和蛋白的表达量均明显降低。

进一步对小鼠血液、脾脏和十二指肠中病毒载量进行检测发现，感染早期的小鼠十二指肠和脾脏中病毒载量逐渐升高，血液中病毒载量逐渐下降。然而，在BVDV感染的第7天病毒载量均达到高峰，这与实验室前期构建的BVDV感染小鼠模型结果相一致[9]。通过病理组织学检查证明BVDV感染后引起了病理损伤，感染模型成立。NLRP3炎症小体活化及病毒载量变化规律表明NLRP3炎症小体在病毒感染早期被激活后，在一定程度上抑制了病毒的复制，但对病毒感染后期抑制效果不明显。值得注意的是，小鼠十二指肠、脾脏和血液的病毒载量在感染第7天最高，第10天的病毒载量开始下降，可能是特异性免疫应答被激活，其机制有待于进一步研究。

综上所述，在小鼠体内，BVDV感染早期的NLRP3炎性小体被激活，然而随着宿主体内病毒载量增加，可能对其激活具有一定的抑制作用。本研究初步揭示了BVDV感染与NLRP3炎症小体活化的相关性，为BVDV拮抗宿主先天性免疫的机制研究奠定了基础。然而，BVDV感染本体动物后NLRP3炎症小体激活及其抗病毒机制仍有待于进一步研究。