基于主成分和聚类分析评价12种植物酵素品质

魏雪琴，李雯，李丙国，耿露菲，林雨诗，庞杰

（1.武夷学院茶与食品学院，福建 武夷山 354300；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

近年，随着酵素的日益盛行[1]，其相关行业标准 （QB/T 5323—2018《植物酵素》、QB/T 5324—2018《酵素产品分类导则》）目前已发布并实施。据报道，食用植物酵素多以新鲜果蔬、菌菇、中草药等单一或复合植物为原料，经多种益生菌发酵而成，含有丰富的维生素、氨基酸、多糖、多酚、酶、矿物质和微生物次生代谢产物等营养成分[2-4]，并具有抗氧化、抗菌消炎、调节肠道菌群、解酒、增强机体免疫能力等多种功能[5-6]。农用植物酵素、日化植物酵素、环保植物酵素等非食用植物酵素也含有丰富的活性成分，包括抗氧化类物质、功效酶和有机酸等[7]，并具有多功能性，如可抑制病原微生物和腐败细菌等有害微生物的活动[8]；具有溶解剩余活性污泥、净化污水等作用，可用于个人护理、土壤改良、环境治理与保护等领域[9-10]。

On the Fruitful Practice of Xi Jinping’s Eco-civilization Thought in Jiangxi Province Hua Ming

对表达思想感情强烈的课文，教师应多花点精力，指导学生进行表情朗读，以读激情，引起共鸣。《再见了，亲人》一文的语言感情充沛，运用了比较多的祈使句、感叹句等句式，来表达赞美、感激、关切、崇敬等感情内容，字里行间洋溢着中朝人民的深情厚谊。教学时，为了让学生体会这种感情，我指导学生朗读重点句、重点片断，通过齐读、指名读、默读、轻声读等，从多次反复的朗读中激发他们的感情，从而体会到中朝人民的友谊确实是比山还高比海还深，是用鲜血凝成的。

酵素制备的传统工艺多偏向采用能有效保留原料活性成分的自然发酵法，通过添加蜂蜜、红糖或白糖等外源碳源提高酵素营养价值及功效，发酵周期一般为几个月至2年不等[11-12]。自然发酵过程中，发酵原料、发酵碳源、发酵时间等均对植物酵素品质具有重要影响。据报道，果蔬酵素中，滇橄榄酵素品质优于由柠檬、青梅、火龙果、诺丽果、食用仙人掌等原料制备的酵素[13]；不同配方酵素酶活力具有差异，且与酵素产品原料种类不成正比[14]；松针酵素陈酿期间，各组分经氧化还原、酯化、缩合、聚合等复杂生理生化反应，其营养成分会增加或减少，其中发酵2年的松针酵素营养价值最高[15]；适当的延长发酵时间有利于提高咖啡果皮酵素蛋白质、总酚、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐阳离子[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）cation，ABTS+]自由基和 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力等综合指标[16]；添加红糖有利于改善葡萄酵素微生物的生长代谢并提高其营养价值，而添加蜂蜜制备的葡萄酵素，其酵母菌数量增长速度及最大细胞浓度明显高于添加红糖组[17]。

植物酵素发酵过程涉及的生物化学反应复杂，过程难以控制，因而建立简易的综合品质评价方法对植物酵素质量管理及其产业发展具有重要意义。目前，关于不同原料、不同碳源植物酵素的综合品质评价较少。因此，本研究选用不同原料，基于相同配比添加蜂蜜或红糖制备12种植物酵素，采用主成分分析和聚类分析，对其品质进行综合分析，构建植物酵素品质综合评价模型，筛选出高品质植物酵素的发酵原料，旨在为酵素品质的科学评价及功能性酵素产品研发提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

芦丁、没食子酸标准样品（色谱纯，纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；福林酚试剂：上海麦克林生化科技有限公司；浓硫酸、盐酸（分析纯）：三明市三圆化学试剂有限公司；总蛋白定量（total protein，TP）测试盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测试盒、DPPH自由基清除能力测试盒：南京建成生物工程研究所；其余化学试剂均为国产分析纯。酵素原料、蜂蜜、红糖：市售。

1.2 仪器与设备

V-1100D型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ReadMax 1200型酶标仪：上海闪谱生物科技有限公司；AR224CN型电子分析天平、Starter型pH计：上海奥豪斯仪器有限公司；DRP-9162型电热恒温培养箱、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海培英实验仪器有限公司；SB-25-12DT型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；WP-UP-UV-20型超纯水机：四川沃特尔科技发展有限公司；HH-S4型恒温水浴锅：常州中捷实验仪器有限公司；TopPette系列移液枪（200 μL/1 mL/5 mL）：大龙兴创实验仪器有限公司；QL-901型涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

2.3.2 综合评价

采用Excel2010进行数据整理和绘图。采用PASW statistics 18.0软件进行方差分析、Duncan’s多重比较差异显著性检验、Pearson相关性分析，显著性水平P＜0.05，数据表示为平均值±标准差。利用PASW statistics 18.0中的Z-score描述性统计对筛选的品质指标数据进行数据标准化，最后进行主成分分析和聚类分析。

学生通过案例讨论后，经过提炼和归纳总结，教师做简洁的总结，回顾案例分析的整个过程，对学生在讨论过程中出现的问题进行分析和评价，继续进行补充和完善，加深对理论知识的理解，使学生能够得到进一步的启发。

翻转课堂能够实现知识内化于知识传授之间的紧密互动和配合，学生可以结合个人的学习经验和学习内容，在学习实践的过程之中主动地参与老师所组织的各种教学活动，老师也可以通过翻转课堂的有效实践来了解学生的知识学习情况和掌握情况，从而在后期进行针对性的教学调整，真正地为学生提供有效的帮助，对学生的问题进行答疑解惑。许多英文老师提出翻转课堂能够不断的调动学生的主观能动性，实现英语专业翻译教学水平的综合提升。

表1 酵素试样信息Table 1 The information of Jiaosu samples

总酸含量测定：采用pH计电位滴定法，参照GB/T 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》，结果以g/kg表示；粗多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法，参照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》，测定波长为490 nm；总蛋白含量测定：采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法，取稀释的酵素离心上清液20 μL，按照试剂盒说明书进行具体操作，测定波长为562 nm；总酚含量测定：采用Folin-Ciocalteu比色法[18]，以没食子酸质量浓度为横坐标（x，μg/mL），以吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.020 0x+0.000 2，R2=0.999 1，测定波长为765 nm；总黄酮含量测定：采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[19]，以芦丁质量浓度为横坐标（x，mg/mL），以吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程为：y=6.623 8x+0.001 4，R2=0.999 2，测定波长为510 nm。

北京市境内北运河流域，一级至五级支流110条，总长1 562km。其中一级支流2条，河道长度138km；二级支流25条，河道长度609km；三级支流56条，河道长度588km；四级支流23条，河道长度195km；五级支流4条，河道长度32km。

1.3.2 基本理化指标测定

1.3.3 酶活力及抗氧化能力测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力测定：采用水溶性四唑盐（water soluble tetrazolium，WST-1）法测定酵素中SOD酶活性。取待测样本20 μL、酶工作液20 μL和底物应用液200 μL混匀，置于电热恒温鼓风干燥箱37℃孵育20 min，在波长为450 nm时用酶标仪比色读取吸光度。

在碎片化学习的时代，学习者必须突破浅层学习的局限，以实现深度学习。碎片化学习中信息的片段化拾取往往是零碎的甚至闲散的，这样的信息获取往往缺乏对内容的深入思考，不能建立信息的广泛联系，学习仅仅停留在浅层面，不易进行学习的推理。如果学习只能停留在这种无组织、孤立的知识片段层面，也就难以超越碎片化导致的浅层学习局限。超越碎片化实现深层学习，是探索解决碎片化问题的要义。

T-AOC测定：取离心后的酵素原液100 μL，按照T-AOC测定试剂盒说明书进行具体操作，测定波长为520 nm。在37℃时，每分钟每毫升试样溶液使反应体系的吸光度每增加0.01，计为一个总抗氧化能力单位，酵素试样中总抗氧化能力以U/mL表示。

DPPH自由基清除能力测定：取离心后的酵素原液400 μL，按照试剂盒说明书进行具体操作，测定波长为517 nm。DPPH自由基清除率按下式计算。

式中：A0为样品液+80%甲醇的吸光度；A1为工作液+样品液的吸光度；A2为工作液+80%甲醇的吸光度。

1.4 数据处理与分析

将新鲜酵素原料、碳源和水按1∶3∶10的质量比装桶混合，进行室温（20℃～30℃）发酵。经1个月定期排气并搅拌后，密封，自然发酵2年，离心（10 000 r/min）10 min，室温（20℃～30℃）贮藏备用。酵素的具体信息如表1所示。

2 结果与分析

2.1 酵素理化指标与抗氧化能力比较

2.1.1 基本理化指标测定结果

表2为12种酵素总酸、粗多糖、总蛋白、总黄酮、总多酚含量。

表2 不同酵素基本理化指标Table 2 Physicochemical properties of different Jiaosu samples

由表2可知，12种酵素总酸含量差异较大，其中4号胎菊蜂蜜酵素总酸含量最高，达23.21 g/kg，其次为10号梨皮、柚子皮红糖酵素（22.02 g/kg）。2号滇橄榄蜂蜜酵素（7.31 g/kg）与8号玫瑰花红糖酵素（7.44 g/kg）总酸含量无显著差异（P＞0.05），5号松花蜂蜜酵素总酸含量最低（1.41 g/kg）。粗多糖含量中，8号玫瑰花红糖酵素（97.73 mg/mL）最高且与其他酵素存在显著差异（P＜0.05），其次是11号柚子皮红糖酵素（72.80 mg/mL），而4号胎菊蜂蜜酵素（9.99 mg/mL）与6号生姜、红枣红糖酵素（9.98 mg/mL）无显著差异（P＞0.05）；3号洛神花蜂蜜酵素（4.12 mg/mL）与9号滇橄榄红糖酵素（3.60 mg/mL）之间的粗多糖含量接近，无显著差异（P＞0.05），5号松花蜂蜜酵素粗多糖含量最低，为2.26mg/mL。总蛋白含量中，8号玫瑰花红糖酵素（77.60 mg/mL）最高，其次是2号滇橄榄蜂蜜酵素（72.20 mg/mL）及9号滇橄榄红糖酵素（72.71 mg/mL）且二者含量无显著差异（P＞0.05），6号生姜、红枣红糖酵素总蛋白含量最低（5.99 mg/mL）。12种酵素总黄酮含量变化范围为0.22 mg/mL～3.32 mg/mL，其中含量最高的是8号玫瑰花红糖酵素（3.32 mg/mL），其次是4号胎菊蜂蜜酵素（2.25 mg/mL），6号生姜、红枣红糖酵素最低（0.22 mg/mL）。总多酚含量中，2号滇橄榄蜂蜜酵素（7.42 mg/mL）显著高于其他11种酵素，3号洛神花蜂蜜酵素（1.11 mg/mL）、10号梨皮、柚子皮红糖酵素（1.09 mg/mL）和12号柚子皮、香蕉皮红糖酵素（1.00 mg/mL）总多酚含量接近，无显著差异（P＞0.05），5号松花蜂蜜酵素总多酚含量（0.74 mg/mL）最低。由以上结果可知，不同原料酵素的理化成分存在较大差异，其中8号玫瑰花红糖酵素的粗多糖、总蛋白、总黄酮含量均显著高于其他11种酵素；相同原料不同发酵碳源酵素之间的理化成分也有差异，如8号与1号酵素原料均为玫瑰花，2号与9号酵素原料均为滇橄榄，但由于发酵碳源不同，其总酸、粗多糖、总黄酮、总多酚含量均存在显著差异。

2.1.2 SOD酶活力测定结果

不同酵素的SOD酶活力如图1所示。

图1 不同酵素SOD酶活力Fig.1 The SOD enzyme activity of different Jiaosu samples

由图1可知，8号玫瑰花红糖酵素SOD酶活力（234.45 U/mL）最高且与其他酵素存在显著差异（P＜0.05），其次是10号梨皮、柚子皮红糖酵素（211.66 U/mL）、4号胎菊蜂蜜酵素（204.91 U/mL）、9号滇橄榄红糖酵素（138.38 U/mL）、2号滇橄榄蜂蜜酵素（130.04 U/mL）、1号玫瑰花蜂蜜酵素（128.70 U/mL），而5号松花蜂蜜酵素SOD酶活力最低，为55.30 U/mL。其中，4号胎菊蜂蜜酵素与10号梨皮、柚子皮红糖酵素、1号玫瑰花蜂蜜酵素与2号滇橄榄蜂蜜酵素、11号柚子皮红糖酵素与12号柚子皮、香蕉皮红糖酵素之间的SOD酶活力无显著差异（P＞0.05）。

作者所在医院于2012年作为北京第一家试点医院，实施了法人治理机制改革，由北京市医院管理局作为授权经营国有资产的出资人代表，任命了医院理事会,以理事长为法人代表，落实公立医院的独立法人地位，实现公立医院所有权和经营权分离的委托代理关系。

2.1.3 总抗氧化能力测定结果

不同酵素的总抗氧化能力如图2所示。

图2 不同酵素总抗氧化能力Fig.2 The total antioxidant capacity of different Jiaosu samples

由图2可知，12种酵素中总抗氧化能力最强的酵素为2号滇橄榄蜂蜜酵素，总抗氧化能力大小排序为2号滇橄榄蜂蜜酵素＞8号玫瑰花红糖酵素＞1号玫瑰花蜂蜜酵素＞9号滇橄榄红糖酵素＞4号胎菊蜂蜜酵素＞3号洛神花蜂蜜酵素＞7号红枣枸杞红糖酵素≈11号柚子皮红糖酵素＞10号梨皮柚子皮红糖酵素＞5号松花蜂蜜酵素＞12号柚子皮香蕉皮红糖酵素≈6号生姜红枣红糖酵素。其中，以滇橄榄和玫瑰花为原料制备的酵素抗氧化能力显著高于其他原料的酵素。

2.1.4 DPPH自由基清除率测定结果

经矩阵分析主成分与原始品质指标变量间的相关系数，得到酵素8个品质指标的载荷量，其绝对值越高，说明关系越密切。酵素品质变量因子荷载矩阵及成分得分系数矩阵见表5。

图3 不同酵素DPPH自由基清除率Fig.3 The DPPH free radical scavenging rate of different Jiaosu samples

由图3可知，1号玫瑰花蜂蜜酵素（89.5%）、2号滇橄榄蜂蜜酵素（89.2%）、4号胎菊蜂蜜酵素（90.4%）、7号红枣枸杞红糖酵素（89.2%）、8号玫瑰花红糖酵素（89.4%）的DPPH自由基清除能力相当并显著高于其他酵素（P＜0.05），3号洛神花蜂蜜酵素的DPPH自由基清除率最低，仅为34.9%。

2.2 酵素品质指标的相关性分析

不同酵素各品质指标变量间的相关性见表3。

表3 酵素品质指标间的相关性分析Table 3 Correlation analysis among quality indexes of Jiaosu

由表3可知，总抗氧化能力与总蛋白、总多酚呈极显著正相关（P＜0.01），与总黄酮呈显著正相关（P＜0.05）；DPPH自由基清除率与总黄酮、总多酚呈极显著正相关（P＜0.01），与总蛋白、SOD酶活力呈显著正相关（P＜0.05），说明蛋白质、多酚、黄酮类等生物活性物质及SOD酶是植物酵素抗氧化作用的重要因子，对抗氧化能力具有重要贡献。

2.3 酵素品质指标的主成分分析及综合评价

2.3.1 主成分分析

但是飞水时间一定不要过长，尤其是贝壳类等小海鲜。正确的操作方法是：锅中水沸腾时将小海鲜下锅，焯水15 s后，捞出沥水。此时的贝壳类海鲜多呈半开半闭状态（小体积的也可能全部打开了），去壳取肉，进行下一步烹饪。

为更好评价不同指标对植物酵素品质的贡献作用，同时明确不同原料酵素的品质差异，采用主成分分析建立不同酵素的综合评价指标。通过KOM检验法和Bartlett球体检验法进行主成分分析的适用性检验，可知KMO=0.654＞0.5，说明各指标之间存在一定的相关性。Bartlett球体检验结果为57.865，显著性为0.001（P＜0.01），说明各个指标之间相互关联。以上两项检验结果均表明12种植物酵素的总酸、粗多糖、总蛋白、总黄酮、总多酚、SOD酶活力、总抗氧化能力及DPPH自由基清除率8个指标数据适合进行主成分分析。各个主成分的特征值、方差贡献率和累积方差贡献率见表4。

表4 主成分的方差贡献率Table 4 Variance contribution ratios of principal components

主成分分析中，把特征值大于1作为提取主成分的标准[20]。由表4可知，当提取3个主成分时，方差贡献率分别为51.639%、21.072%、15.572%，累积方差贡献率达88.284%，说明这3个主成分涵盖了原始变量主要信息。并且，前3个主成分的特征值均大于1，分别为4.131、1.686、1.246，故提取因素能够反映酵素品质的总体特征。

不同酵素在相同稀释倍数下DPPH自由基清除率如图3所示。

表5 酵素品质变量因子荷载矩阵及成分得分系数矩阵Table 5 Factor loading matrix and component score coefficient matrix of of Jiaosu quality variable

由表5可知，主成分1与总蛋白、总黄酮、总多酚、总抗氧化能力、DPPH自由基清除率等关系密切，均呈正相关，主要反映酵素活性成分及抗氧化能力信息；主成分2与总酸、SOD酶活力关系密切，呈正相关；主成分3与粗多糖关系密切，呈正相关。

1.3.1 酵素的制备

根据成分得分系数与相对应指标的标准化数据乘积的加和，得到3个主成分得分，设提取的主成分得分依次为F1、F2、F3，可得到酵素品质3个主成分的函数表达式。

从心理学的视角看，与空间观念有着密切联系的概念有空间知觉、空间表象、空间想象和空间能力。“观察物体”需要学生在头脑中对原有的“表象”进行加工，融入一部分“空间想象”解决眼前的问题。通过调研发现，“观察物体”让学生感到困难的主要原因是：学生缺少空间知觉的支撑，难以形成空间表象，没有表象自然无从想象，而“当空间想象受阻时，提供操作材料动手实验，是行之有效的教学对策”[3]。培养空间能力的一个重要条件就是让学生看到、接触到学习的对象。那么是否可以设计一节实验课，以丰富学生的空间知觉为目标，从而促进学生空间能力的发展呢？

将各主成分所对应的方差贡献率作为权重，得到主成分的综合评价模型。

“纯天然”的不都是自然的产品，它只是商家推出的宣传用语，并非国家权威机构的认证标志。美国食品和药品管理局（FDA）根本就没有对这个词汇下过定义。我国的相关标准中，也没有“纯天然”这一项。因此，商家在这些食品里添加合格的着色剂、人工香料等“合成材料”并不违法。商家利用“纯天然”作为宣传手段，让消费者以为其是“绿色”产品，有误导之嫌。

根据各主成分得分函数表达式计算出12种植物酵素各主成分的得分情况，同时根据综合评价模型计算出12种植物酵素品质的综合得分，综合得分越高，说明该酵素的品质越好，结果如表6所示。

表6 主成分得分和排名Table 6 Principal component score and ranking

由表6可知，8号（玫瑰花红糖酵素）总蛋白、总黄酮、总多酚、总抗氧化能力、DPPH自由基清除率均较高，对主成分1的贡献最大，故综合得分最高，品质最优；其次为4号（胎菊蜂蜜酵素）、2号（滇橄榄蜂蜜酵素）、1号（玫瑰花蜂蜜酵素）、9号（滇橄榄红糖酵素），四者综合得分较接近，品质较相近；而11号（柚子皮红糖酵素）、3号（洛神花蜂蜜酵素）、12号（柚子皮香蕉皮红糖酵素）、6号（生姜红枣红糖酵素）、5号（松花蜂蜜酵素）总黄酮含量较低，总抗氧化能力、DPPH自由基清除率和SOD酶活力较低，对主成分1和主成分2贡献均较小，综合得分较低，品质较差。1号与8号酵素原料均为玫瑰花，2号与9号酵素原料均为滇橄榄，但由于发酵碳源不同，其综合品质亦有差异。

目前随着大众生活水平的提高，也开始注意口腔方面的健康。临床上，口腔牙列疾病属于一种较为常见的疾病，此病的发病率是随着患者年龄增长而升高的，此病的临床症状主要表现为牙齿松动、咬合能力差以及牙髓炎症导致的疼痛等，对于有合并高血压、心脏病以及糖尿病等并发症有着较大的治疗难度。以往治疗口腔疾病的主要治疗手段就是口腔修复，但是有着一定的局限性，会对患者牙齿的美观程度造成一定的影响，大部分患者都不太能够接受，目前正畸治疗正逐渐应用在了口腔修复的治疗中，保证牙齿的美观度[1]。在本次研究中，我院对口腔疾病患者的修复治疗中应用了正畸治疗，取得了良好的治疗效果，具体情况如下。

2.4 酵素品质指标的聚类分析

为更加直观地对相似组分信息进行综合分析和评价，体现不同酵素品质指标间的差异，将12种酵素的8个品质指标原始数据进行标准化处理，以平方Euclidean距离为度量标准，以组间连接为聚类方法进行系统聚类分析[21]，结果如图4所示。

图4 酵素品质指标的聚类树状图Fig.4 Dendrogram obtained from cluster analysis of different Jiaosu

由图4可知，当距离约为10时，12种酵素品质指标可划分为3大类。第1类聚集了总黄酮、总多酚、总酸、总蛋白、粗多糖、DPPH自由基清除率；第2类为SOD酶活力；第3类为总抗氧化能力。结合相关性分析和主成分分析结果，DPPH自由基清除率与总蛋白呈显著正相关（P＜0.05，表3），与总黄酮、总多酚呈极显著正相关（P＜0.01，表3），故DPPH自由基清除率可代表总蛋白、总黄酮和总多酚的信息。因此，最终确定总酸、粗多糖、SOD酶活力、总抗氧化能力、DPPH自由基清除率5个品质指标作为酵素品质的核心指标，用于评价酵素品质的优劣。

3 结论

本文对12种不同植物酵素的总酸、粗多糖、总蛋白、总黄酮、总多酚、SOD酶、总抗氧化能力、DPPH自由基清除率8个品质指标进行对比，并对其进行主成分分析和聚类分析。结果表明，植物酵素8个品质指标之间存在差异性和相关性，主成分分析法将8个品质指标简化为3个主成分，主成分1主要反映植物酵素活性成分及抗氧化能力信息；主成分2主要反映总酸含量及酶活力信息；主成分3反映粗多糖含量信息；3个主成分累积方差贡献率为88.284%，反映了酵素品质的绝大部分信息。由主成分分析法得出的综合评价模型显示，以玫瑰花为发酵原料制备的酵素综合品质较优。通过聚类分析将不同酵素的8个品质指标划分为3类，结合相关性和主成分分析结果，确定总酸、粗多糖、SOD酶活力、总抗氧化能力、DPPH自由基清除率等5项核心指标，可用于评价酵素品质的优劣。植物酵素发酵原料和品质指标数量等研究范围还有待于扩大并进一步发掘植物酵素品质评价的规律性，为酵素研究与开发提供参考。

SPSS19.0统计,计量资料给予的检验方式是t检验,计数资料则实施χ2检验,P<0.05显示差异显著。