普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

赵振祥，崔露莹，周东波，赵泽玉，张银霞，盖梦琦，解敏敏，蒲文宣，彭 宇，李志远*

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

赵振祥1，崔露莹2，周东波1，赵泽玉3，张银霞1，盖梦琦2，解敏敏2，蒲文宣1，彭 宇1，李志远2*

（1.湖南中烟工业有限责任公司技术中心，长沙 410007；2.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业基因资源利用重点实验室，青岛 266101；3.湖北中烟工业有限责任公司三峡卷烟厂，湖北 宜昌 443100）

Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物特有的一类转录因子，在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用，本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明，在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子，其Dof功能域在进化上十分保守，根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明，烟草中的16个基因与拟南芥17个基因有27个共线性基因对，同时，25个基因被检测到存在17个全基因组复制对，表明复制事件在烟草基因家族的扩张中起关键作用。此外，表达模式分析表明基因的表达存在明显的组织特异性，其中和基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析，为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。

普通烟草；Dof转录因子；鉴定；比较基因组学；表达模式

转录因子（Transcription factors, TFs）可以识别并结合下游靶基因启动子上的顺式作用元件，进而调控下游基因的表达[1]。DNA结合单锌指蛋白（DNA binding with one finger, Dof）是植物特有的一类转录因子，其成员均含有一个由52个氨基酸组成的Dof保守功能域[2]。Dof功能域呈现为C2C2型锌指结构，能够特异识别序列为5'-AAAG-3'的顺式作用元件[3-4]。Dof转录因子在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用[5]。

研究表明，Dof转录因子参与种子萌发、组织分化以及碳氮代谢等生理生化过程[6-7]。例如，玉米中的基因与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的表达有关，且异源过表达基因能显著提高转基因拟南芥中的氮含量[8-9]。同时，在玉米中过表达能够促进籽粒中淀粉的生物合成，而可溶性糖和还原糖的合成则受到抑制[10]。在水稻中，OsDOF18转录因子可以影响根系对氨的吸收和转运[11]。在拟南芥中，过表达会影响植物细胞的大小和数量，导致植株矮化[12]。而可以抑制种子萌发，并且可通过调控种子萌发正向调节因子（TCP14）的表达来调控ABA胁迫相关基因的表达[13]。

Dof转录因子还被报道参与植物非生物胁迫反应。在拟南芥中，的表达受到盐、干旱、高温和脱落酸的诱导，并且过表达基因可提高拟南芥对非生物胁迫的耐受程度[14]。在番茄中，过表达的转基因植株对干旱的抵抗能力显著提升[15]。在小麦中，包括TaDof16、TaDof26和TaDof96在内的多个Dof转录因子被证实参与多种非生物胁迫反应[16]。

自第一个Dof转录因子从玉米中鉴定和克隆出来后[17]，不同植物中的Dof转录因子被陆续鉴定和分析。在拟南芥[5]、水稻[18]、小麦[16]和马铃薯[19]中分别鉴定了36、30、96和35个Dof转录因子。烟草是一类重要的叶用经济作物，同时也是用来研究基因功能的重要模式生物。目前，已有部分烟草Dof转录因子的功能被鉴定。例如，在烟草中过表达可以激活基因的转录，进而增强转基因植株对烟草花叶病毒病的抗性[20]。此外，和基因同样也被证明在烟草防御反应中发挥着重要作用[21]。SIERRO等[22]在2014年公布了白肋烟TN90和烤烟K326的参考基因组。基于白肋烟TN90的参考基因组，WEI等[23]在白肋烟中鉴定到60个Dof转录因子，并将其分为8个不同类群，但并未进行深入分析。2017年，Edwards进一步提高了烤烟K326基因组的组装质量，将其组装到染色体水平[24]。上述研究为全基因组水平上烟草基因家族的鉴定和分析奠定了基础。

本研究根据最新组装的烤烟K326基因组，对普通烟草中存在的Dof转录因子进行了全面鉴定，并通过系统进化分析、共线性分析和表达模式分析等手段对Dof转录因子进行了研究。为解析烟草Dof家族成员在生长发育和组织分化等过程中的潜在作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为普通烟草烤烟品种K326，2021年3月种植于烟草行业基因资源利用重点实验室人工气候室内。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草Dof转录因子成员的鉴定和序列分析 普通烟草K326蛋白组数据库从茄科数据库（https://solgenomics.net/）下载，并分别在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）中下载已报道的白肋烟TN90[23]和拟南芥的Dof蛋白序列[5]。以拟南芥Dof蛋白序列作为种子序列检索K326蛋白组数据库（E-value＜0.01），得到候选序列。使用SMART和Pfam数据库进一步筛选，去除不含有Dof功能域的序列[25-26]。使用ProtParam工具对烟草Dof成员的理化性质进行分析[27]。

1.2.2 烟草Dof家族成员的多序列比对及系统进化分析 使用MAFFT软件将新鉴定的烟草Dof成员和已报道的拟南芥Dof成员的蛋白序列进行多序列比对[28]。其中Dof功能域序列的比对结果用TBtools软件进行可视化分析[29]。另外根据多序列比对结果，使用MEGA X在默认参数下构建邻接树[30]。

1.2.3 保守基序分析 将拟南芥和烟草的Dof蛋白序列提交至MEME网站，进行其保守基序分析，参数设置如下：保守基序数量设定为10，保守基序长度设定为6至100，并选择ZOOPS scoring模式进行分析[31]。

1.2.4 烟草基因的复制事件及共线性分析 首先使用普通烟草K326的全基因组序列与拟南芥的全基因组序列进行比对分析。利用McScan X软件在默认参数下进行普通烟草基因组和拟南芥基因组的共线性分析[32]。使用ColinearScan软件对烟草基因的复制事件进行鉴定和分析[33]。

1.2.5 转录组数据处理及结果分析 在NCBI的GEO数据库(登录号：GSE95717)中下载烟草基因在出苗后8周的根、茎和茎尖组织表达数据[24]，使用R语言中HeatMap函数绘制不同组织的表达热图[34]。

2 结 果

2.1 烟草Dof转录因子家族成员鉴定和理化分析

根据拟南芥Dof蛋白序列对烟草蛋白数据库进行检索，得到的候选序列用Pfam数据库分析候选序列含有的Dof保守结构域后，最终共在普通烟草K326基因组中鉴定到69个烟草Dof转录因子。根据基因在染色体上的定位，对69个基因进行重命名（-）。如表1所示，烟草Dof转录因子成员在理化性质上存在差异，其中氨基酸数目在128～527之间，相对分子量大小在14.70 ～58.48 kDa之间，而其成员的理论等电点在4.51～9.78之间（表1）。

表1 普通烟草Dof转录因子家族成员鉴定及理化性质分析

表1 （续）

2.2 烟草Dof家族成员保守结构与进化分析

烟草中的Dof功能域（图1A）和拟南芥的Dof功能域（图1B）极为相似，这说明Dof转录因子在物种进化过程中是高度保守的。特别地，在C1、C4、C26和C29等位点完全保守，暗示这些位点对Dof转录因子发挥其生物学功能起着重要的作用。

系统进化分析表明（图2），普通烟草K326中新鉴定的Dof成员可划分为9个亚家族。值得注意的是，所有的亚家族均含有拟南芥和烟草的Dof转录因子，暗示拟南芥和烟草的物种分化时间要晚于Dof转录因子的分化时间。特别地，在部分亚家族中烟草Dof成员的数量远多于拟南芥。例如，在亚家族III和VIII中分别含有1个拟南芥Dof转录因子，而普通烟草K326中上述两个亚家族均存在4个Dof转录因子。这说明在普通烟草和拟南芥物种分化后，第III和VIII亚家族的成员又经历了复制事件，导致了上述亚家族成员的扩张。

普通烟草K326和白肋烟TN90中的Dof转录因子相比，在III和VII亚家族中的Dof转录因子具有一一对应的关系。然而，在白肋烟TN90中鉴定到的亚家族IV、VI和VIIIDof转录因子数量明显少于普通烟草K326。特别地，在亚家族VI中含有4个由普通烟草K326鉴定到的Dof转录因子，而白肋烟TN90的Dof转录因子在此亚家族中不存在。在亚家族I和V中，由白肋烟TN90鉴定到的Dof转录因子数量则明显多于普通烟草K326（图2）。

注：*代表在Dof结构域中保守的半胱氨酸。Note: * represents the conserved cysteine residues in the Dof domain.

图2 烟草Dof家族成员的系统进化分析

2.3 烟草Dof家族成员蛋白保守基序分析

利用MEME在线工具对拟南芥和烟草Dof成员的保守基序进行了分析（图3）。结果显示，相同亚家族Dof成员的保守基序组成和排列具有相似性，暗示相同亚家族的Dof成员可能行使着类似的功能。Dof功能域由motif1和motif2组成，在所有烟草Dof转录因子中均存在该结构域。特别地，某些保守基序是部分亚家族所特有的，比如Motif10仅在第II亚家族存在，表明Motif10可能对第II亚家族成员的功能具有重要作用。

2.4 烟草Dof家族成员的共线性分析

为进一步分析Dof家族成员在拟南芥和烟草两个物种中的分化关系，使用McScan X对两个物种的基因组进行共线性分析。如图4所示，At01-At05和Nt01-Nt24分别代表拟南芥的5条染色体和烟草的24条染色体，其中灰色线条代表拟南芥和烟草所有的共线基因对，红色线条表示基因。结果显示，来自拟南芥基因组的17个Dof家族成员与来自烟草中的16个Dof成员共组成27个共线基因对。共线性分析结果进一步说明所鉴定的烟草与拟南芥的基因直系同源。

2.5 烟草Dof家族成员的全基因组复制事件分析

全基因组复制分析可以更好地解析NtDof家族成员的进化关系，利用McScan X对烟草基因组进行复制事件分析。如图5所示，灰色线条表示烟草基因组中所有的复制基因对，而红色线条表示烟草基因间形成的复制基因对。结果表明，烟草基因组中共有25个基因共形成17个全基因组复制基因对，表明这些基因来源于一次或多次复制事件，同时全基因组复制事件在烟草Dof转录因子家族的扩张过程中发挥重要作用。

图3 普通烟草Dof家族成员的保守基序分析

图4 烟草和拟南芥Dof基因的共线性分析

图5 烟草Dof基因全基因组复制分析

2.6 烟草Dof基因不同组织表达模式分析

从NCBI数据库中下载并提取烟草基因在根、茎和茎尖中的表达数据，使用Heatmap程序进行可视化展示（图6）。结果所示，新鉴定的烟草基因3个测试组织中的表达模式各不相同。其中，、、和等9个基因未检测到表达，而、和等基因在所有组织中均有表达。此外个别基因的表达具有组织特性行为，例如、和在茎尖中表达量较高，而和仅在根处检测到表达且表达量处于较低水平。特别地，和基因在根中高表达，而在茎和茎尖中的表达则处于较低水平，说明这两个基因可能参与植物根系生长发育过程。

图6 烟草Dof基因家族成员的表达模式分析

3 讨 论

本研究采用比较基因组学的方法对烟草基因组中的Dof转录因子进行了鉴定，并从系统进化、共线性、复制事件、保守基序和表达模式等方面对新鉴定的烟草Dof转录因子进行了分析。

本研究发现所鉴定的烟草Dof转录因子均含有高度保守的Dof功能域，证明Dof蛋白在物种的进化过程中是高度保守的。系统进化分析发现，烟草和拟南芥的Dof家族成员可划分为9个亚家族，并且所有亚家族均含有烟草和拟南芥的成员，暗示在进化过程中Dof转录因子家族的分化时间要早于烟草和拟南芥的物种分化时间。复制事件分析结果表明，烟草中共有25个基因发生了复制事件，证明复制事件在烟草Dof家族扩张过程中起关键性作用。

WEI等[23]对白肋烟TN90中Dof转录因子进行了筛选，共鉴定到60个Dof转录因子。本研究对普通烟草K326基因组中的Dof转录因子进行了鉴定，共鉴定到69个Dof转录因子。在进化过程中，白肋烟TN90和普通烟草K326的部分基因可能发生了丢失或复制，因此导致鉴定到的Dof转录因子数量产生差异。另一方面，EDWARDS等[24]对普通烟草K326的基因组进行了重新组装和注释，进一步提高了普通烟草K326的基因组质量。本研究根据质量更高的普通烟草K326基因组对Dof转录因子进行鉴定，鉴定结果更加准确，更有利于下一步开展基因功能研究。

在亚家族I中，与和、、等基因聚在一起且直系同源。此外与被报道参与拟南芥种子的萌发[35-37]，推测、和等基因可能在烟草种子的发育过程中起关键作用。此外，全基因组复制分析发现，分别和、组成复制基因对，说明在烟草和拟南芥物种分化之后，第I亚家族中的烟草Dof成员可能又经历了复制事件。此外，在第IV、V亚家族中也有类似的情况，说明复制事件对烟草Dof转录因子家族的扩张具有重要意义。

在拟南芥中，一些基因被报道参与调控植物的生长发育。例如，（）被证实调控植物根系生长发育过程[38]。在烟草中，基因与组成共线性基因对，二者直系同源。同时，在根中的表达量显著高于其他组织，说明基因可能在根系生长发育过程中发挥调控作用。此外，在第VI亚家族中，AtDof5.1被报道可调控叶片的卷曲程度[39]。在烟草中，NtDof02、NtDof11、NtDof33、NtDof36和NtDof37与AtDof5.1聚类在一起，并且进一步分析发现这些蛋白的编码基因分别和形成共线基因对。有意思的是，他们的表达模式却有差别，例如和在根部的表达量较高，在3个测试组织中均未见表达，说明此家族的Dof成员在功能上可能出现了分化。

4 结 论

本研究利用生物信息学方法从烟草基因组数据库中鉴定到了69个Dof转录因子。系统进化分析发现烟草和拟南芥Dof成员可划分为9个亚家族，并且同一亚家族成员的保守基序组成具有相似性，暗示其可能在功能上具有相似性。另外全基因组复制事件分析发现复制事件在烟草Dof转录因子家族的扩张中起着重要的作用。表达模式分析表明，基因的表达存在组织特异性，可能在植物生长发育及组织分化过程中发挥着重要作用。

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Genome-wide Identification and Systemic Analysis of Dof Transcription Factors in Tobacco (L.)

ZHAO Zhenxiang1, CUI Luying2, ZHOU Dongbo1, ZHAO Zeyu3, ZHANG Yinxia1, GE Mengqi2,XIE Minmin2, PU Wenxuan1, PENG Yu1, LI Zhiyuan2*

（1. Technology Center, China Tobacco Hunan Industrial, Changsha 410007, China; 2. Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 3. Sanxia Cigarette Factory, China Tobacco Hubei Industrial Co., Ltd., Yichang, Hubei 443100, China）

As a plant specific transcription factor family, Dof proteins play important roles in multiple life processes of plant development. To analyze the potential roles of Dof family members in tobacco growth and development, comparative genomics, evolutionary analysis and syntenic analysis were performed to analyze potential function of NtDof members. A total of 69 Dof transcription factors were identified in the tobacco genome, and the Dof domain was highly conserved. The NtDof members were classified into 9 subfamilies based on the phylogenetic analysis. In tobacco, 16genes were found to form 27 collinear pairs with 17genes. The duplication events showed that 25genes were detected to form 17 replication pairs, suggesting that replication events play a key role in the expansion of the tobacco Dof gene family. Furthermore, the expression ofgenes have obvious tissue specificity.andgenes may be involved in root development. Tobacco Dof transcription factors were identified and analyzed in this study, and these results may provide insights for further studies on tobacco Dof family.

tobacco; Dof transcription factors; identification; comparative genomics; expression pattern

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.010

S572.01

A

1007-5119（2022）04-0070-09

湖南中烟工业有限责任公司科技项目（KY2020YC0013）；中国烟草总公司重大专项项目[110201901018（JY-05）]

赵振祥（1969-），男，农艺师，主要从事烟草栽培调制与基因功能研究。E-mail：691890770@qq.com。*通信作者，E-mail：lizhiyuan02@caas.cn

2021-11-11

2022-03-04