γ-聚谷氨酸高产菌株的筛选及改良酸化植烟土壤效果研究

施河丽，彭五星，向修志，舒照鹤，向必坤，王雪松，上官力，尹忠春，祁高富，谭 军*

γ-聚谷氨酸高产菌株的筛选及改良酸化植烟土壤效果研究

施河丽1，彭五星1，向修志1，舒照鹤1，向必坤1，王雪松1，上官力1，尹忠春1，祁高富2*，谭 军1*

（1.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070）

为挖掘具有缓解植烟土壤酸化能力的微生物菌株，采用盆栽试验和大田试验相结合的方法，应用生物形态学和分子生物学筛选鉴定了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）高产菌株并研究其对酸化植烟土壤的改良效果。结果表明：（1）从黄土高原干旱土壤中筛选得到一株谷氨酸非依赖型γ-PGA高产菌株副地衣芽孢杆菌285-3（）；（2）菌株285-3可有效缓解根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化，土壤pH平均提高0.3个单位以上；（3）菌株285-3配施有机肥，可显著降低酸化植烟土壤可交换酸度，对烟草青枯病的防效达到47.05%，同时提高烟叶产质量。综上所述，副地衣芽孢杆菌285-3对酸化植烟土壤有较好的改良效果，与有机肥合用具有控病和提高烟叶产质量的作用。

酸化植烟土壤；副地衣芽孢杆菌；γ-聚谷氨酸；烟草青枯病；烟叶产质量

土壤酸化进程的加速，既受外源氮沉降、酸沉降的影响，又受化学肥料施用、植物选择性吸收、根系呼吸及根系分泌物等影响[1]。近年来我国烟区土壤酸化日趋严重[2]，导致青枯病等土传病害的发生及流行加重[3-4]，对烟草生长和优质烟叶生产产生严重影响。目前对酸化土壤的改良主要是改变施肥方式以及使用土壤改良剂，如传统的土壤改良剂生石灰（或石灰粉）、沸石、白云石、粉煤灰等，以及新型的土壤改良剂如牡蛎壳粉、生物质炭、腐殖酸等。随着研究的不断深入，化学改良剂的弊端逐渐显现，如长期施用生石灰导致土壤板结、肥力下降[5-6]，不利于烟叶生产的长远发展。因此，有学者提出利用生物技术改良酸化土壤的方法，特别是利用微生物对酸化土壤进行修复[7-8]。芽孢杆菌具有适应性广、成本低、货架期长、使用方便等优点，因而受到广泛关注。芽孢杆菌还能产生多种有益次生代谢产物，如多肽、环肽、氨基酸、蛋白酶及香豆素等，其中γ-聚谷氨酸（γ-PGA）就是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等产生的高聚物[9]。γ-PGA主链上具有大量游离羧基，有很强的吸水保湿功能，可以改善土壤团粒结构，起到保水保肥作用[10-12]；还可以直接中和土壤中的氢离子以及为金属阳离子的吸附提供位点，减少碱性阳离子的淋失，提高土壤的缓冲能力，从而维持土壤pH的稳定[13-14]。

本文从山西吕梁地区黄土高原干旱土壤中筛选获得一株谷氨酸非依赖型γ-PGA高产菌株副地衣芽孢杆菌285-3（），并研究其对酸化植烟土壤的改良效果。首先利用盆栽试验研究该菌株对根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化的影响，然后利用大田试验研究该菌株与有机肥合用对酸化植烟土壤、烟草青枯病以及烟叶产质量的影响，为利用γ-PGA高产菌株改良酸化植烟土壤和防治烟草青枯病建立研究基础。

1 材料与方法

1.1 γ-PGA高产菌株的筛选和鉴定

2019年1月从山西吕梁交城地区黄土高原采集土壤，称取10 g，加入90 mL ddH2O悬浮土壤，置沸水浴5 min。冷却后将土壤悬液进行梯度稀释，于LB固体平板上进行涂布，37 ℃培养24 h，挑选形态大、表面光滑、湿润、粘度高的单菌落。

将挑选的单菌落接入到发酵培养基（葡萄糖30.0 g/L，柠檬酸钠10.0 g/L，氯化铵8.0 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，六水合三氯化铁0.04 g/L，无水氯化钙0.15 g/L，一水合硫酸锰0.1 g/L，pH 7.4）中，37 ℃、180 r/min培养36 h，所得发酵液经12000 r/min离心10 min后收集上清液，然后采用CTAB比浊法定量测定各菌株发酵上清液中γ-PGA产量[15]。

选取γ-PGA产量最高的菌株，将其在LB固体平板上划线分离单菌落，37 ℃培养24 h后观察菌落形态，并利用结晶紫染色后观察细胞形状和芽孢。采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen）并参照说明书方法提取菌株DNA，以16S通用引物（16SF：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；16SR：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）进行PCR扩增。PCR反应体系为：正反向引物各1 µL，模板2 µL，2×Taq Master super Mix 25 µL，ddH2O 21 µL。PCR扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物纯化后由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行Blast比对，然后利用MEGA 5.2软件的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。

1.2 菌株缓解土壤酸化盆栽试验

盆栽试验于2021年5—7月在湖北省武汉市华中农业大学微生物农药国家工程研究中心进行。供试烤烟品种为云烟87。盆栽试验土壤采集于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园镇锣圈岩村，土壤类型为山地黄棕壤，土壤质地为壤土，土壤pH为5.50～5.90。将试验土壤装于高10 cm、直径12 cm的圆形塑料花盆，移栽6片真叶烟苗，每盆1株，移栽成活后备用。有机酸溶液为苯甲酸180 mg/L，3-苯丙酸180 mg/L，延胡索酸180 mg/L，琥珀酸84 mg/L。

1.2.1有机酸溶液模拟根系分泌物导致的土壤酸化对照组（CK）和处理组（285-3）烟苗分别于第0天、第14天和第28天灌施有机酸溶液20 mL/株，模拟烟株根系分泌物导致的土壤酸化。第1次有机酸处理后，处理组烟苗灌施菌株285-3发酵液（稀释5倍）20 mL/株，对照组烟苗灌施空白发酵培养基（稀释5倍）20 mL/株。

1.2.2 复合肥料导致的土壤酸化 对照组（CK）和处理组（285-3）烟苗分别于第0天、第14天和第28天施用烟草专用复合肥9.75 g/株，模拟复合肥料导致的土壤酸化。第1次复合肥处理后，处理组烟苗灌施菌株285-3发酵液（稀释5倍）20 mL/株，对照组烟苗灌施空白发酵培养基（稀释5倍）20 mL/株。

1.3 菌株改良酸化植烟土壤大田试验

田间试验于2021年4—9月在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园镇锣圈岩村四组进行。供试烤烟品种和土壤类型同上述盆栽试验。试验开始前耕层（0～20 cm）土壤的基本理化性质为：土壤pH 4.47，有机质21.90 g/kg，碱解氮136.00 mg/kg，有效磷243.10 mg/kg，速效钾302.00 mg/kg。

试验设置4个处理，分别为：T1（CK），不施菌株285-3发酵液和菜籽饼肥；T2，单施菌株285-3发酵液2250 L/hm2；T3，单施菜籽饼肥1500 kg/hm2；T4，菌株285-3发酵液2250 L/hm2+菜籽饼肥1500 kg/hm2。每个处理3次重复，随机区组设计。2021年5月1日移栽，每小区3行，每行20株，行距1.20 m，株距0.55 m。施肥配比为(N)∶(P2O5)∶(K2O)=1∶1.5∶3，各处理具体施肥量见表1。烟草专用复合肥、磷肥和菜籽饼肥作为底肥，硝铵磷肥作为提苗肥，硫酸钾作为追肥。菌株285-3发酵液（稀释5倍）在烟苗移栽15 d后灌施。

表1 各处理基本情况

1.4 样品采集与分析方法

盆栽试验第1次处理后，每隔7 d用五点法从花盆10～20 cm土层中采集土样；大田试验在烟叶成熟采收结束后，用五点法采集每个小区0～20 cm耕层土壤。将采集的土壤样品混匀后自然风干、去杂、研磨和过筛，然后用于测定土壤基本化学性质。土壤pH采用电位法（水土比2.5∶1）[16]，阳离子交换量采用三氯化六氨合钴浸提-分光光度法[17]，可交换酸度、可交换氢和可交换铝采用氯化钾提取-滴定法[18]。

依据GB/T 23222—2008调查各处理在旺长期和成熟期烟草青枯病的发生情况，计算发病率、病情指数和防治效果。依据GB 2635—1992进行烟叶分级，计算烟叶产量、产值、均价等经济指标。

1.5 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010软件进行处理，DPS 15.10统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 γ-PGA高产菌株的筛选和鉴定

2.1.1 γ-PGA高产菌株的筛选 将采集的土壤经高温煮沸后杀死不能形成芽孢的微生物，然后适当稀释后涂布LB平板，发现稀释度为10-5涂布后生长出来的菌落能够较好分开，每个平板约31～56个菌落。根据文献报道，γ-PGA生产菌株的菌落多为粘稠扩散形态，据此初筛得到11株菌落形态较为粘稠扩散的菌株。将各菌株的单菌落接种于发酵培养基中进行培养，然后采用CTAB比浊法定量测定各菌株发酵液中γ-PGA产量。由表2可知，筛选得到的11株菌均能生产γ-PGA，产量在7.18～20.70 g/L之间，其中以菌株285-3的产量最高。

表2 各菌株γ-PGA的产量

2.1.2 γ-PGA高产菌株的鉴定 首先利用解剖镜对菌株285-3的单菌落进行形态学观察，发现该菌株菌落光滑湿润，边缘规整，中部凸状隆起不透明；菌落颜色为淡黄色、有光泽、呈球形乳液状；粘液挑起有明显的拔丝效果（图1A）。表明菌株285-3的菌落表面覆盖大量γ-PGA分子，从而导致菌落形态粘稠，符合γ-PGA生产菌株的特征。结晶紫染色后，在显微镜下可见菌体为短杆状，有芽孢（图1B），结合该菌株分离时的沸水浴处理，推测菌株285-3为芽孢杆菌。

为了进一步确定菌株285-3的分类，利用相近芽孢杆菌的16S rDNA基因序列构建系统发育树，发现菌株285-3与Bac48的遗传距离最近，聚于同一个分支（图2），且同源性为100%。因此，结合上述形态特征及分子生物学鉴定结果，将菌株285-3鉴定为副地衣芽孢杆菌（）。

注：A，菌落形态；B，芽孢。Note: A, Colony; B, Spore.

图2 基于16S rDNA序列构建的菌株285-3的系统发育树

2.2 菌株285-3缓解土壤酸化盆栽试验效果

通过添加有机酸模拟根系分泌物对土壤的酸化作用，发现处理组和对照组的土壤pH随时间的变化曲线较为平缓，但处理组土壤pH在多个时间点显著高于对照组，较对照组平均提高了0.31个单位（图3A）。通过添加烟草专用复合肥模拟复合肥料对土壤的酸化作用，发现处理组和对照组的土壤pH随时间的变化曲线呈持续下降趋势，处理组土壤pH在多个时间点也显著高于对照组，较对照组平均提高了0.36个单位（图3B）。盆栽试验结果表明，菌株285-3具有缓解根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化的能力。

注：A，根系分泌物导致的土壤酸化；B，复合肥料导致的土壤酸化；**表示在0.01概率水平上差异显著；*表示在0.05概率水平上差异显著。

Note: A, soil acidification caused by root exudates; B, soil acidification induced by compound fertilizer; ** is significantly at the 0.01 probability levels; * is significantly at the 0.05 probability levels.

图3 菌株285-3发酵液对盆栽土壤pH的影响

Fig. 3 Effect of strain 285-3 fermentation broth on pH of potted soil

2.3 菌株285-3改良酸化植烟土壤的大田试验效果

2.3.1 对酸化植烟土壤化学性质的影响 由表3可知，部分处理在土壤可交换酸度、可交换铝和可交换氢等指标间差异达到显著水平。T3处理和T4处理的土壤可交换酸度显著低于T1处理（CK），T1处理（CK）、T3处理和T4处理的土壤可交换铝显著低于T2处理，T2处理的土壤可交换氢显著低于T1处理（CK）。说明单施菌株285-3、单施菜籽饼肥、菌株285-3与菜籽饼肥合用都对酸化植烟土壤具有一定的改良效果。

2.3.2 对烟草青枯病发生的影响 由表4可知，旺长期各处理烟草青枯病发病率和病情指数都较低。成熟期各处理烟草青枯病发生明显加重，但T4处理的发病率和病情指数均显著低于T3处理。与T1处理（CK）相比，T4处理对烟草青枯病的防效为47.05%，说明菌株285-3与菜籽饼肥合用对烟草青枯病具有较好的防控效果。

2.3.3 对烟叶经济性状的影响 表5表明，不同处理在烟叶产量和产值间差异达到显著水平，其中T1处理（CK）和T3处理的产量均显著低于T4处理，T3处理的产值显著低于T4处理。与T1处理（CK）相比，T4处理的增产率和增值率均为最高，分别为15.20%和8.57%；T2处理的增产率和增值率次之，分别为3.51%和0.85%；T3处理的产量和产值均低于T1处理（CK）。以上结果表明，菌株285-3与菜籽饼肥合用有利于增加烤后烟叶经济性状。

表3 不同处理的土壤化学性质

注：同一列中小写字母不同表示处理间差异显著（<0.05），下同。

Note: Different lowercase letters in the same columu indicate significant differences between treatments(<0.05), the same below.

表4 不同处理烟草青枯病的发生情况

Table 4 Occurrence of tobacco bacterial wilt in different treatments

表5 不同处理的经济性状

3 讨 论

γ-PGA是一种可由多种微生物合成的，具有生物降解性的水溶性生物高分子材料，在农业上可用作土壤改良剂[19-20]。目前报道的γ-PGA生产菌株大多是芽孢杆菌属，根据发酵过程中是否添加谷氨酸，可将γ-PGA生产菌株分为谷氨酸依赖型菌株和谷氨酸非依赖型菌株。许多微生物高产γ-PGA的时候需要外源添加谷氨酸作为底物，而土壤中往往匮乏谷氨酸，如果可以不依赖于外源添加谷氨酸就能生产较高产量的γ-PGA，能够从葡萄糖开始经糖酵解（EMP）途径和三羧酸（TCA）循环自己合成谷氨酸，则理论上更有利于菌株在土壤中发挥缓解酸化的作用[21]。本研究从黄土高原干旱土壤中筛选获得一株谷氨酸非依赖型菌株，并将该菌株鉴定为副地衣芽孢杆菌，其γ-PGA产量达到20.70 g/L，而谷氨酸非依赖型菌株γ-PGA产量达到20 g/L以上的少见报道[22-23]。

通过盆栽试验发现，菌株285-3对根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化都具有明显的缓解和改善作用，处理组土壤pH较对照组平均提高0.30个单位以上，且在多个时间点显著高于对照组。用有机酸模拟根系分泌物处理土壤后，对照组土壤pH并没有明显下降，可能是施加的有机酸被土壤中的细菌作为碳源所利用，实际上许多微生物都可以利用有机酸作为碳源[24]。用烟草专用复合肥处理土壤后，对照组土壤pH持续下降，而菌株285-3处理组土壤pH在多个时间点高于初始pH，一方面可能是因为施用的复合肥料被菌株285-3作为氮源所利用，另一方面菌株285-3生产的γ-PGA对酸、碱具有极佳的缓冲能力，可有效平衡土壤酸碱值，缓解因长期使用化学肥料引起的土壤酸化现象[25]。虽然γ-PGA在农业中有多种应用，如土壤保墒、重金属治理、肥料增效等，但作为酸化土壤改良剂则报道较少。

进一步将菌株285-3用于大田酸化植烟土壤的改良发现，单施菌株285-3、单施菜籽饼肥以及菌株285-3与菜籽饼肥合用对于酸化植烟土壤改良都有一定的效果，而菌株285-3与菜籽饼肥合用对烟草青枯病防治和烟叶产质量提升的田间效果更佳。单施285-3发酵液可能因菌株不能在土壤中有效定殖而无法充分发挥其效果[26]。由于饼肥在土壤微氧的环境中发酵产生有机酸[27]，而这些酸类物质会对烟株根系的生长发育产生抑制作用，因此单施菜籽饼肥对于烟草青枯病防治和烟叶产质量提升的效果较差。菜籽饼肥与菌株285-3合用田间效果最佳。菜籽饼肥既可以起到疏松土壤、改善土壤微生物群落、增加营养元素等作用[28]，又可以为菌株285-3在土壤中的扩繁与根际定殖提供必要的营养以及为合成γ-PGA提供所需的原料[29-30]。此外，γ-PGA在改善土壤特性[31]、增强土壤持水能力、减少养分流失[32]、促进根区微生物群的生长[33]等方面都具有良好的效果，能使作物更有效的吸收土壤中的水分和养分，促进根系生长发育，提高作物对土传病害的抵抗能力。前人已将γ-PGA作用于多种作物，并表现出明显的促生长和增产作用[34]。

4 结 论

本研究从黄土高原干旱土壤中筛选得到一株谷氨酸非依赖型γ-PGA高产菌株，将其鉴定为副地衣芽孢杆菌285-3（）。该菌株具有缓解根系分泌物和复合肥料导致的土壤酸化的作用；在大田与有机肥合用不仅对酸化植烟土壤有较好的改良效果，而且能防控烟草青枯病和提高烟叶产质量。本研究为今后利用微生物及γ-PGA对酸化土壤进行修复提供了技术支持和借鉴指导。

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Screening of Poly-γ-glutamic Acid Producer and its Effect on Improving Acidified Tobacco Planting Soil

SHI Heli1, PENG Wuxing1, XIANG Xiuzhi1, SHU Zhaohe1, XIANG Bikun1, WANG Xuesong1, SHANG Guanli1, YIN Zhongchun1, QI Gaofu2*, TAN Jun1*

（1. Enshi Prefecture Company of Hubei Provincial Tobacco Corporation, Enshi, Hubei 445000, China; 2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China）

In order to explore the microbial strains with the ability to alleviate the acidification of tobacco planting soil, a combination of biomorphology and molecular biology, pot experiment and field experiment were used to screen and identify high-yielding γ-PGA strains and study their improvement effects on acidified tobacco planting soil. The results showed that: (1) Aglutamate-independent γ-PGA producing strain285-3 was screened from the arid soil of the Loess Plateau. (2) Strain 285-3 effectively alleviated soil acidification caused by root exudates and compound fertilizers, and increased soil pH by more than 0.3 units on average. (3) The combination of strain 285-3 and organic fertilizer significantly reduced the exchangeable acidity of acidified tobacco planting soil, and the control effect of tobacco bacterial wilt reached 47.05%, while improved the yield and quality of tobacco. In conclusion,285-3 has a good improvement effect on acidified tobacco plating soil, and can control disease and improve yield and quality of tobacco when combined with organic fertilizer.

acidified tobacco planting soil;; γ-PGA; tobacco bacterial wilt; tobacco yield and quality

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.003

S572.01

A

1007-5119（2022）04-0015-07

中国烟草总公司湖北省公司科技项目（027Y2019-011）

施河丽（1984-），女，硕士研究生，主要从事烟草栽培与微生物工程研究。E-mail：shiheli2022@163.com

，E-mail：祁高富，qigaofu@mail.hzau.edu.cn；谭军，tanjun20713@163.com

2022-03-07

2022-08-09