增碳减氮对植烟土壤微生物的影响

董鸣豪，武云杰，李钠钾，汪忠坪，王保兴，汪代斌，马 啸，赵龙杰，叶协锋，李 奇，江厚龙*

增碳减氮对植烟土壤微生物的影响

董鸣豪1，武云杰1，李钠钾2，汪忠坪1，王保兴3，汪代斌2，马 啸4，赵龙杰4，叶协锋1，李 奇5*，江厚龙2*

（1.河南农业大学烟草学院，郑州 450002；2.中国烟草总公司重庆市公司，重庆 400023；3.云南中烟工业有限责任公司，昆明 650202；4.重庆市烟草公司丰都分公司，重庆 408200；5.浙江中烟工业有限责任公司，杭州 310008）

为探究不同增碳减氮措施对植烟土壤养分及微生物群落结构的影响，以云烟116为研究对象，设置常规施肥（CF）和3个增碳减氮处理[常规施肥减氮10%，分别加施菇渣有机肥750 kg/hm2（MO）、高碳基肥600 kg/hm2（HB）、生物有机肥750 kg/hm2（BO）]，测定其土壤碳氮养分及微生物群落结构。结果表明，MO处理土壤全碳和有机质含量较常规施肥CF分别显著增加了23.62%和25.05%；与CF相比，MO处理酸杆菌门、绿弯菌门两个优势菌门相对丰度更高，慢生根瘤菌属（）相对丰度也明显高于其他处理；HB处理上述菌群相对丰度仅次于MO处理，BO处理上述菌群相对丰度最低，而镰刀菌属、腐质霉属等致病菌属在HB处理中相对丰度最低。研究表明，菇渣有机肥配合减氮措施在促进土壤碳、氮养分释放，改善土壤微生物群落结构，提升养分利用率方面效果最佳。

有机肥；减量施氮；土壤微生物

烤烟作为一种重要的经济作物，产量对其经济效益有重要影响。多年来，由于对产量的片面追求，重施氮肥现象在烟叶生产中普遍存在，造成了土壤有机质降低、酸化板结等问题，阻碍了土壤养分供应[1-2]，导致土壤微生物数量减少，烟叶质量下降。同时，过量氮肥大量淋失造成了环境污染[3-4]，已经成为制约我国优质烟叶生产主要因素之一。

近年来，随着人们对发展绿色农业的重视，有机肥广泛应用于农业生产[5-9]。研究表明[10-11]，有机肥可有效增加土壤有机质，提升土壤碳氮比，改善土壤理化性质，进而促进土壤养分转化与烟株养分吸收，增加土壤微生物多样性，从而促进烤烟产质量提升。金亚波等[12]研究表明，施用有机物料可以提升植烟土壤速效养分，增加土壤大团聚体比例，提升团聚体稳定性。陈山等[13]研究表明，生物炭可以显著提升植烟土壤有机碳、有机质含量，改善土壤碳氮比。姜佰文等[14]研究发现，减氮配施有机肥可显著提升植株干物质积累量，提高土壤养分利用率。因此人们把目光聚集在增施有机肥与控制化肥氮用量上，以期探索出能够满足节肥增效和可持续发展的土壤改良措施。钱旎等[15]对重庆12个区(县)烟田土壤的养分分析表明，pH适宜的土壤仅占全市烟区土壤的38.8%，土壤碱解氮和速效钾含量偏高，需要严格控制氮肥用量，进一步加强土壤改良，以提升烟叶的产量和品质。本研究在重庆烟区开展了增施有机物料并减少化肥氮施用试验，研究其对土壤碳、氮养分和土壤微生态的影响，为植烟土壤改良和优质烟叶生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2020年5—9月在重庆市丰都县太平坝乡（E 108°9′，N 29°44′）进行，供试烤烟品种为云烟116。土壤基础养分为：有机质18.75 g/kg，全氮2.03 g/kg，碱解氮85.22 mg/kg，pH 5.23，速效磷183.82 mg/kg，速效钾289.83 mg/kg。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，共设4个处理，如表1所示。CF，常规施肥氮111 kg/hm2，(N)∶(P2O5)∶(K2O)=1∶1∶3；各处理减氮的同时，保持磷钾肥用量不变。磷肥、钾肥分别用过磷酸钙和硫酸钾补充，肥料种类及养分含量见表2。

表1 试验处理设计

表2 试验主要肥料信息

4月11日进行烟田整地、施肥及起垄，所有物料于起垄前一天条施。烟苗于5月7日进行移栽，大田管理参照当地优质烟叶生产技术措施。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 土壤样品采集 于移栽后90 d（2020年8月7日）采集烟草根际土壤样品。每个小区按照S形取样法选取6株烟，挖取根部，采用抖根法采集根际土壤。将各点土样混匀，去除植物根系及其余杂物后，过1 mm筛置于10 mL无菌管中，用于16S rRNA和ITS基因高通量测序。

于移栽后120 d（2020年9月7日）采集烟草0～20 cm耕层土壤样品，每个小区按照S形取样法选取6个点的土壤混匀合成1个土样。土样取好后于阴凉处风干，剔除异物研磨过筛后，检测土壤碳、氮指标。

1.3.2 土壤碳、氮指标分析[16]有机质含量采用重铬酸钾容量法；碱解氮测定采用碱解扩散法；全氮采用凯氏定氮法；采用VarioEL III型元素分析仪测定样品中全碳含量；腐殖质采用熊毅-傅积平改进法。1.3.3 土壤微生物测定 采用Fast DNA® Spin Kit（Qbiogene，Inc.USA）试剂盒提取土壤总DNA。细菌16S rRNA用338F（5'-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）引物进行PCR扩增，真菌ITS用ITS5- 1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS2-2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）引物进行PCR扩增。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，合格后使用NovaSeq6000进行测序。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 23.0，和https://magic.novogene.com/平台进行数据分析制图。

2 结 果

2.1 对土壤碳、氮养分含量的影响

由表3可知，各增碳减氮处理土壤全碳、有机质含量较CF均有提升，其中MO土壤全碳、有机质含量较CF显著提升了23.62%、25.05%。土壤腐殖质中，各增碳减氮处理土壤胡敏酸含量均显著高于CF，以HB土壤胡敏酸含量最高，其次为BO。

2.2 对土壤微生物结构的影响

2.2.1 土壤微生物样本测序结果 对4个处理共12个样品进行基因高通量测序，得到787 791个Raw reads，对低质量与短长度序列及嵌合体进行过滤后，得到优质序列440 418条，平均长度为413.17 bp。以97%的一致性进行OTUs聚类，得到2180个OTU。从土样中获得16S细菌和ITS真菌粗读数后，经过质量筛选和嵌合体过滤，回收细菌54 757～72 962个，真菌82 569～94 543个，均为高质量读数。序列被聚为2180个细菌OTU和1345个真菌OTU，其中CF、MO、HB、BO特有细菌OTU数目分别为298、140、87、130，特有真菌OTU分别为218、169、163、301。由图1A可以看出，在细菌中，抽样读数大约在5000以下时，细菌种（属）类数迅速增加；读数在5 000～15 000之间，细菌种（属）数缓慢增加；读数超过15 000之后，其种（属）类数的增长逐渐趋于平缓；由图1B可以看出，在真菌中，抽样读数大约在10 000以下时，真菌种（属）类数迅速增加；读数在10 000～20 000之间，真菌种（属）数缓慢增加；读数超过20 000之后，其种（属）类数的增长逐渐趋于平缓。由此说明所取得土壤微生物样品具有代表性。

表3 不同处理土壤碳、氮养分含量

注：不同小写字母表示在＜0.05（Tukey's-b test）水平上差异显著。下同。

Note: different lowercase letter indicates significant difference at＜0.05(Tukey's-b test). The same as below.

图1 细菌（A）与真菌（B）稀释曲线

2.2.2 对土壤微生物α多样性的影响 微生物群落Alpha多样性可以体现微生物群落多样性与丰富度，其中Shannon指数越高，多样性越高，物种分布越均匀；Chao1指数则代表了样品中包含的物种总数，即群落丰富度。如表4所示，各处理测序深度指数均在0.99以上，说明测序结果可以反映样本真实情况。各增碳减氮处理细菌OTUs数目即观测的物种数均少于CF处理，其中HB与CF差异最小；各处理Shannon指数均低于CF，但差异不显著；CF Chao1指数显著高于MO和BO。真菌Alpha多样性分析表明，MO处理OTUs数目、Shannon指数与Chao1指数均高于其他处理，而HB、BO处理的OTUs数目、Shannon指数与Chao1指数均低于CF，但各处理之间差异不显著。

表4 微生物Alpha多样性统计表

2.2.3 对土壤微生物β多样性的影响 运用NMDS对4个处理土壤微生物群落组成差异进行了分析（图2），各处理点间距离代表差异程度。由图2A可知，CF细菌群落组成与其余各处理细菌群落组成存在差异，MO细菌群落组成与CF差异最大；HB和BO细菌群落组成较为接近。由图2B可知，CF与其余各处理真菌组成存在差异，MO、HB真菌群落与CF差异更加明显，说明菇渣有机肥与高碳基肥对真菌群落结构影响更大。

MRPP分析表明（表5），CF-MO的细菌与真菌群落结构均表现为组内差异大于组间差异，其余两两处理间细菌与真菌群落结构差异均表现为组间差异大于组内差异（值大于0说明微生物群落结构组间差异大于组内差异；Observe delta值越大说明组内差异大，Expect delta值越大说明组间差异大）。在细菌中，BO-CF的组间差异最大，BO-HB的组内差异最小；真菌中，CF-HB的组内差异最小，BO-HB和BO-MO的组间差异均最大。

2.2.4 对土壤微生物群落构成的影响 由图3可知，在门水平上，土壤细菌优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、unidentified_Bacteria、绿弯菌门（Chloroflexi），其丰度之和超过细菌总丰度的75%。与CF相比，MO、HB、BO处理变形菌门相对丰度分别降低了16.07%、21.59%、13.62%，而酸杆菌门、unidentified_Bacteria、绿弯菌门相对丰度均有6.15%～42.99%的提升。其中，酸杆菌门与绿弯菌门相对丰度均以MO处理最高。此外，所有增碳减氮处理中WPS-2相对丰度均高于常规施肥的土壤；HB处理芽单胞菌门、拟杆菌门相对丰度提升优于其余处理。

图2 土壤微生物细菌（A）和真菌（B）NMDS分析图

表5 微生物MRPP分析表

由图4可知，在属水平上，各处理优势细菌属为鞘氨醇单胞菌属（）、、TM7、JG30a-KF-32、芽单胞菌属（）、慢生根瘤菌属（）和r。在优势属中，MO、HB、BO处理鞘氨醇单胞菌属、较CF相对丰度降低，JG30a-KF-32、慢生根瘤菌属相对丰度较CF有所提升，其中MO、BO处理的JG30a-KF-32、慢生根瘤菌属相对丰度最高。BO处理褚氏杆菌属相对丰度高于CF，HB、BO处理芽单胞菌属相对丰度较CF明显提升。同时，各处理TM7相对丰度较CF均明显降低。

图3 门水平上的细菌相对丰度

图4 属水平上的细菌相对丰度

根据各处理不同细菌属水平相对丰度进行显著差异分析，由图5可知，CF与BO有6个细菌属具有显著差异，BO优势菌属相对丰度显著高于CF，HB优势菌属慢生根瘤菌属（）显著高于CF；其余处理间显著性差异菌属均为稀有菌属。

图5 各处理细菌属水平显著性差异分析

由图6可知，门水平上真菌优势菌门分别为子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门(Mortierellomycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、担子菌门(Basidiomycota)、合霉菌门(Chytridiomycot)、隐菌门(Rozellomycota)、油壶菌门（Olpidiomycota），其中增碳减氮处理子囊菌门相对丰度占比均超过50%。与CF相比，增碳减氮处理子囊菌门相对丰度分别降低了8.56%、7.12%、1.28%。同时，较CF，各处理均提升了被孢霉门相对丰度；MO提升了毛霉门相对丰度；HB、BO提升了担子菌门相对丰度。合霉菌门、隐菌门在各处理中相对丰度均较小且在不同处理中相对丰度变化不大。

图6 门水平上的真菌相对丰度

由图7可知，属水平上真菌优势菌属为短梗蠕孢属（）、被孢霉属（、镰刀菌属（）、无梗囊霉属（）、毛霉菌属（）、木霉菌属（和腐质霉属（），各处理优势菌属相对丰度之和占各群落总丰度的51.45%～58.45%。与CF相比，MO、BO、HB处理短梗蠕孢属相对丰度均有所降低，而被孢霉属、无梗囊霉属及毛霉菌属相对丰度明显提升。MO与HB处理木霉菌属相对丰度较CF降低，而BO处理木霉菌属相对丰度较CF升高。

根据各处理不同真菌属水平相对丰度进行差异显著性分析，由图8可知，BO处理菌属相对丰度显著高于CF，MO处理被孢霉属显著高于CF。其余处理间菌属均差异不显著。

图7 属水平上的真菌相对丰度

图8 各处理真菌属水平差异显著性分析

2.3 土壤环境因子与微生物群落的相关性分析

对土壤微生物与土壤养分的冗余分析结果表明（图9），RDA1和RDA2上的解释量分别为27.1%和21.65%，胡敏酸、富里酸对细菌群落结构影响显著（<0.05），其中富里酸影响最大。对真菌而言，在RDA1和RDA2上的解释量分别为22.93%和20.37%，全氮、全碳、碱解氮、有机质、腐殖酸、胡敏酸对土壤真菌群落结构的影响显著（<0.05），富里酸影响较小（>0.05）。

注：TN，全氮；TC，全碳；AN，碱解氮；OM，有机质；HA，腐殖酸；MA，胡敏酸；FA，富里酸。

3 讨 论

本研究结果表明，各增碳减氮处理可提升土壤有机质与全碳含量，这与王兴龙等[17]和于法辉等[18]研究结果一致。一方面增碳减氮处理可直接提升土壤碳含量，另一方面有机肥的施用为微生物繁殖提供碳源，促进了土壤微生物活性提升，进而增加了土壤养分转化潜力[19]。

Alpha多样性指数是评价微生物群落丰富度与多样性的重要指标，多样性指数越高表明多样性与丰富度越高[20]。本研究中增碳减氮处理并未显著改变土壤真菌群落丰富度，但降低了细菌群落丰富度，其中MO、BO处理细菌群落Chao1指数显著低于CF，这可能是由于氮肥的减少降低了部分富养型微生物的相对丰度，导致物种分布均匀度降低和微生物群落丰富度与多样性下降[20-21]。

增碳减氮处理对土壤微生物群落结构组成影响较大，各增碳减氮处理细菌群落酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度上升，变形菌门（Proteobacteria）相对丰度降低。研究表明，酸杆菌门作为一种嗜酸菌，不但受土壤pH影响，还受到有机质含量等因素影响[22]，本研究中，MO处理有机质显著高于CF，同时酸杆菌门相对丰度较CF明显提升，表明有机质可以促进酸杆菌门丰度提升；此外，酸杆菌门多属于寡营养类群，土壤氮营养减少时也有利于其种群繁殖[23]。酸杆菌门、绿弯菌门参与碳循环[24]，尤其是绿弯菌门具有将大分子有机物降解至小分子有机物的能力[25]，主要参与土壤碳、氮的固定[26-28]。MO处理的酸杆菌门、绿弯菌门、慢生根瘤菌属（）相对丰度最高，表明MO处理对土壤碳、氮的固定能力有明显提升。子囊菌门、被孢霉门（Mortierellomycota）为真菌中的优势菌门，而各增碳减氮处理子囊菌门相对丰度均低于CF。研究表明[29]，施用氮肥可以提升子囊菌门相对丰度，因此其相对丰度的下降应与减氮有关。在真菌群落属水平上，各增碳减氮处理被孢霉属（）、无梗囊霉属（）及毛霉菌属（）相对丰度提升，短梗蠕孢属相对丰度降低，腐质霉属相对丰度以BO处理最高。无梗囊霉属可以促进烟株养分吸收、提升烟株抗病性[30]，进而促进烟株生长。本研究也发现HB处理镰刀菌属、腐质霉属相对丰度均低于CF，镰刀菌属与腐质霉属均属于致病菌[31]，其丰度降低有利于降低病害发生。此外，HB处理在绿弯菌门丰度仅次于MO处理，这与施河丽[20]等研究结果中高碳基肥可相对提升土壤有机质含量并降低镰刀菌属、腐质霉属等致病菌属丰度的结果一致。可以看出，MO处理相较其他处理可更好的提升碳、氮代谢相关菌群丰度；HB处理可降低致病菌群丰度。

4 结 论

增碳减氮措施可不同程度的改善土壤碳、氮养分状况以及土壤微生物群落结构。土壤腐殖酸是影响土壤微生物的关键因素。常规施肥减氮10%并增施菇渣有机肥750 kg/hm2处理对土壤碳养分增幅最大，提升慢生根瘤菌属、无梗囊霉属等碳氮代谢菌群相对丰度。

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Effects of Different Measures of Increasing Carbon and Decreasing Nitrogen on Soil Microbes in Tobacco Planting Fields

DONG Minghao1, WU Yunjie1, LI Najia2, WANG Zhongping1, WANG Baoxing3, WANG Daibin2, MA Xiao4, ZHAO Longjie4, YE Xiefeng1, LI Qi5*, JIANG Houlong2*

(1. Tobacco College of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. China National Tobacco Corporation Chongqing Company, Chongqing 400023, China; 3. Yunnan Tobacco Industrial Co., Ltd., Kunming 650202, China; 4. Chongqing Tobacco Company Fengdu Branch, Chongqing 408200, China; 5. Zhejiang Tobacco Industrial Co., Ltd., Hangzhou 310008, China)

In order to explore the effects of different carbon-increasing and nitrogen-reducing measures on soil nutrients and microbial community structure of tobacco planting fields, taking flue-cured tobacco Yunyan 116 as the research object, conventional fertilization (CF) and 3 carbon-increasing and nitrogen-reducing treatments [On the basis of conventional fertilization, reduce nitrogen by 10% and add mushroom residue organic fertilizer 750 kg/hm2(MO), high carbon base fertilizer 600 kg/hm2(HB), and biological organic fertilizer 750 kg/hm2(BO)] were conducted, and the soil carbon and nitrogen nutrients and microbial community structure were determined. The results showed that compared with the conventional fertilization CF, the contents of total carbon and organic matter in the soil treated with MO were significantly increased by 23.62% and 25.05%, respectively; The relative abundance of the two dominant bacterial phyla, Acidobacteria and Chloroflexi, was higher in MO treatment, and the relative abundance ofwas also significantly higher than that in other treatments. The relative abundance of the above bacterial groups in the HB treatment was just lower than the MO treatment, and the relative abundance of the above bacterial groups in the BO treatment was the lowest. The relative abundance of HB treatment was the lowest among pathogenic bacteria such asand. The results from this study have shown that mushroom residue organic fertilizer combined with nitrogen reduction measures has the best effect in promoting the release of soil carbon and nitrogen nutrients, improving soil microbial community structure, and improving nutrient utilization.

organic fertilizer; reduced nitrogen application; soil microorganisms

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.004

S572.01

A

1007-5119（2022）04-0022-10

中国烟草总公司重庆市公司项目[A2020NY01-1303（1）；（A20201NY01-1304）]

董鸣豪（1996-），男，主要从事烟草栽培生理研究。E-mail：dmh6096@foxmail.com

，E-mail：李 奇，liqi@zjtobacco.com；江厚龙，jhl513@163.com

2021-11-21

2022-06-29