基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨针药联合治疗病毒感染后嗅觉障碍的疗效及调控机制*

丁晓明，郑丽红，孔菲，柏杉

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第四医院消化内科，黑龙江哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学附属第四医院内分泌科，黑龙江哈尔滨 150001；4. 黑龙江中医药大学附属第二医院耳鼻喉科，黑龙江哈尔滨 150000）

嗅觉具有识别环境、辨识气味、促进食欲等作用，而嗅觉障碍不仅严重影响人的生活质量，还会导致精神抑郁[1]。鼻窦炎症性疾病、病毒感染和头部创伤是诱发嗅觉障碍的主要致病因素，其中病毒感染后嗅觉障碍占所有门诊嗅觉障碍患者的18.6%～29.3%[2]。相关研究显示，病毒感染后嗅觉障碍继发于细菌、真菌或病毒，包括近年的新冠病毒——严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS CoV-2）[3]。当前临床治疗病毒感染后嗅觉障碍的首选药物为糖皮质激素、维生素A 和银杏提取物等[4]，但治疗效果不甚理想，治愈率不高，且部分药物会诱发类似鼻刺激和鼻出血等并发症。

针灸是传统中医的治疗方式之一，具有副作用小、成本低、能缓解许多慢性免疫性疾病等优点，在耳鼻喉科也广泛应用。例如，针灸治疗可降低患者耳鸣程度[5]、耳穴针刺可缓解成人扁桃体切除术后疼痛[6]、针灸治疗变应性鼻炎的临床效果不亚于药物治疗[7]。此外，亦有研究证实针灸在帮助病毒感染后嗅觉障碍患者恢复嗅觉功能及缓解病情具有较好的疗效[8]，但其具体机制尚不清楚。

髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）/Toll 样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）/核转录因子-κB（nuclear factor-ĸB, NF-κB）信号通路的激活与嗅觉障碍密切相关。既往研究发现额叶癫痫患者的嗅觉障碍与嗅球组织中TLR4 受体和下游转录因子NF-κB p65 表达显著增加有关[9]。此外，变应性鼻炎诱导的嗅觉功能障碍与嗅球小胶质细胞中TLR4/NF-κB 信号通路激活有关，表现为胶质细胞中TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表达明显上调[10-11]。

因此，本研究拟通过针刺内迎香穴和鼻丘穴联合糠酸莫米松鼻喷雾剂治疗病毒感染后嗅觉障碍，以评估针药联合的临床效果，并进一步探索其调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年6月—2021年12月就诊于黑龙江中医药大学附属第二医院耳鼻喉科的病毒感染后嗅觉障碍患者104 例，随机分为对照组和联合组，每组52 例。纳入标准：①感染前患者主观感受嗅觉正常，有病毒感染或感冒病史；②就诊检查或主诉嗅觉异常、减退或丧失，以及表现出典型的上呼吸道感染症状；③接受类固醇治疗1 个月以上仍未改善或缓解；④同意本研究治疗方案。排除标准：①由于自身慢性免疫性疾病、神经退行性疾病、头部创伤/创伤性脑损伤、精神疾病或医源性原因导致的嗅觉丧失；②既往接受过鼻部或鼻窦手术；③糠酸莫米松鼻喷雾剂禁忌或过敏者；④拒绝参与研究者。两组的性别构成、年龄、病程及嗅觉情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性（见表1）。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较 （n=52）

1.2 方法

1.2.1 治疗方法对照组给予常规鼻用激素糠酸莫米松鼻喷雾剂[默沙东（中国）有限公司，批准文号：H20140100，规格：50 μg×60 揿]治疗，每日喷鼻一次，持续4 周。联合组采用针药联合的治疗方式，即在常规糠酸莫米松鼻喷雾剂治疗的基础上，给予鼻内镜下针灸针（华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司，规格：75 mm）针刺双侧内迎香穴（针尖沿着鼻唇沟向上斜刺约10～15 mm）和鼻丘穴（针尖稍向内上斜刺10～15 mm），平补平泻，不使用特殊手法，留针30 min，1 次/d，持续4 周。两组患者在治疗期间和治疗后均未发生不良事件，顺利完成相应治疗。

1.2.2 Sniffin Sticks 嗅棒测试评估嗅觉功能治疗前后用Sniffin Sticks 嗅棒（德国Burghart Messtechnik有限公司，批号：LA-13-00207）检测两组患者双侧的嗅觉功能。测试时，取下笔帽，笔尖放在两组患者的鼻前15 s，让其在选项卡上选择闻到的气味。该测试由3 项子测试组成，分别为气味阈值（threshold, T）、气味辨别能力（discrimination, D）和气味识别能力（identification, I）。各子测试总分为16分，3 个子测试总分之和为整体嗅觉得分，即48 分。TDI 评分≥30.5 分为嗅觉正常，TDI 评分为＞16.5～＜30.5 分为嗅觉减退，TDI 评分≤16.5 分为嗅觉缺失。治疗前后的TDI评分差值≥6分为治疗成功[12]。

1.2.3 T&T嗅觉计测试评估嗅觉功能将异戊酸、苯乙醇、甲基环戊烯酮、臭粪素和十一烷酸内酯5 种嗅物10 倍稀释，稀释后浓度为10-1～106，并依次标识为-1、0、1、2、3、4、5、6。其中，-1～1 为嗅觉正常，1.1～5.5 为嗅觉减退，＞5.6 为嗅觉丧失。

1.2.4 副鼻窦CT扫描评估嗅裂通气情况用128×2-slice 双源CT 扫描仪[Flash Definition，西门子（中国）有限公司]对两组患者进行高分辨率副鼻窦CT扫描，以评估嗅裂通气情况。根据CT 结果将嗅觉裂隙通气模式分为正常、部分浑浊及完全浑浊。嗅裂通气恢复正常为治愈，正常和浑浊减轻为改善。

1.2.5 Western blotting 检测MyD88、TLR4 和NFκB p65 蛋白相对表达量采集两组患者空腹外周静脉血2 mL，置于肝素钠抗凝管中。加1 mL 放射免疫沉淀法裂解缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：R0010）提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（上海炎熙生物科技有限公司，批号：PD-BCA-500）定量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，滴加一抗anti-MyD88（上海艾博抗贸易有限公司，批号：ab133739，1∶1 000）、anti-TLR4（上海艾博抗贸易有限公司，批号：ab13556，1∶1 000）和anti-NF-ĸB p65（上海艾博抗贸易有限公司，批号：ab288751，1∶1 000），4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3 次，滴加羊抗人IgG H&L 二抗（上海艾博抗贸易有限公司，批号：ab7153，1∶10 000），室温孵育40 min。增强型化学发光（ECL）检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：E412-01）显色，曝光显影。以β-actin 为内参，计算MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白相对表达量。

1.2.6 流式细胞术检测外周静脉血T 细胞亚群CD4+CD25+T 细胞和CD4+CD25highT 细胞的百分率采集两组患者空腹外周静脉血2 mL，置于肝素钠抗凝管中。吸取50 μL 血液至各流式管，以CD3+和CD4+设门，筛选出CD3+CD4+T 细胞，再标记CD25。分别加入10 μL 荧光抗体，充分混匀，室温避光反应15 min。滴加2 mL 溶血素，涡流混匀，室温静置10 min。离心，弃上清液，留存约50 μL 液体，用BeamCyte 流式细胞仪（常州必达科生物科技有限公司）检测外周静脉血T 细胞亚群CD4+CD25+T 细胞和CD4+CD25highT 细胞的百分率。其中，左侧为对照管，右侧为待检管，CD25 平均荧光强度＞102定义为CD4+CD25highT 细胞。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料用均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或配对t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后TDI评分及差值比较

两组患者治疗前TDI 评分比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗4 周后TDI评分比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组高于对照组；两组治疗4 周后和治疗前TDI 评分差值比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

选取2017年1月～2018年4月在本院脊柱科门诊及住院治疗的脊柱骨关节病伴有腰椎不稳患者30例，病程2～15个月，平均（6.45±2.58）个月。

表2 两组患者治疗前后TDI评分及差值比较（n=52，分，±s）

表2 两组患者治疗前后TDI评分及差值比较（n=52，分，±s）

组别对照组联合组t 值P 值治疗前12.35±0.18 12.40±0.22 1.371 0.173治疗4周后15.90±1.54 18.64±1.44 9.369 0.000差值3.56±1.41 6.24±1.29 10.121 0.000

2.2 两组患者T&T嗅觉计测试结果

两组患者治疗前T&T 嗅觉计测试结果比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗4 周后T&T 嗅觉计测试结果比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组低于对照组；两组治疗4 周后和治疗前T&T 嗅觉计测试差值比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组患者治疗前后T&T嗅觉计测试结果及差值比较 （n=52，±s）

表3 两组患者治疗前后T&T嗅觉计测试结果及差值比较 （n=52，±s）

组别对照组联合组t 值P 值治疗前4.58±0.17 4.58±0.16 0.235 0.815治疗4周后3.30±1.16 2.84±1.27 1.956 0.000差值-1.27±1.21-1.74±1.27 1.196 0.024

2.3 两组患者嗅裂通气情况比较

治疗4 周后，对照组嗅裂通气恢复正常9 例，治愈率为17.31%；嗅裂通气改善13 例，改善率为25.00%。联合组嗅裂通气恢复正常15 例，治愈率为28.85%；嗅裂通气改善22 例，改善率为42.31%。对照组和联合组治愈率和改善率比较，经χ2检验，差异均有统计学意义（χ2=4.065 和6.486，P=0.044 和0.011），联合组高于对照组。见表4。

表4 两组患者嗅裂通气模式比较 （n=52，例）

2.4 两组患者静脉血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相对表达量的比较

两组患者静脉血MyD88、TLR4 和NF-κB p65蛋白相对表达量治疗前与治疗4 周后比较，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗4 周后均低于治疗前；两组治疗4 周后静脉血MyD88、TLR4 和NF-κB p65蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组低于对照组。见图1和表5。

表5 两组患者静脉血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相对表达量的比较 （n=52，±s）

表5 两组患者静脉血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相对表达量的比较 （n=52，±s）

注：†与治疗前比较，P ＜0.05。

组别MyD88 TLR4治疗4周后0.64±0.03†0.45±0.05†5.393 0.006治疗4周后0.60±0.04†0.37±0.05†6.605 0.003治疗前0.94±0.03 0.96±0.03 0.926 0.407治疗前0.82±0.04 0.84±0.03 0.894 0.422治疗4周后0.47±0.08†0.33±0.02†3.071 0.037对照组联合组t 值P 值NF-κB p65治疗前0.78±0.05 0.78±0.02 0.104 0.922

图1 两组患者静脉血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白表达

2.5 两组患者静脉血CD4+CD25+ T 细胞和CD4+CD25high T细胞百分率的比较

两组患者静脉血CD4+CD25+T 细胞百分率和CD4+CD25highT 细胞百分率治疗前与治疗4 周后比较，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗4 周后均高于治疗前；联合组与对照组患者治疗4 周后静脉血CD4+CD25+T 细胞百分率和CD4+CD25highT 细胞百分率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组高于对照组。见图2和表6。

表6 两组患者CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25high T细胞百分率的比较 （n=52，%，±s）

表6 两组患者CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25high T细胞百分率的比较 （n=52，%，±s）

注：†与治疗前比较，P ＜0.05。

组别对照组联合组t 值P 值CD4+CD25+T细胞治疗前5.32±0.11 5.34±0.07 1.106 0.271治疗4周后1.05±0.05†1.25±0.07†16.765 0.000治疗4周后5.75±0.04†6.67±0.05†103.609 0.000 CD4+CD25high T细胞治疗前0.92±0.03 0.93±0.06 1.078 0.285

图2 两组患者静脉血CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25high T细胞百分率

3 讨论

病毒感染后嗅觉障碍通常由病毒感染损伤嗅觉通路所致，是获得性嗅觉功能障碍最常见的原因之一，可诱发病毒感染后嗅觉障碍患者永久性嗅觉减退或丧失。特别是近年来新冠病毒SARSCoV-2 肆虐，由此引发的病毒感染后嗅觉障碍后遗症更是引起广泛关注[13]。当前，病毒感染后嗅觉障碍的治疗多采用手术、嗅觉训练、米诺环素、糖皮质激素、银杏叶提取物及α-硫酸锌等治疗方案，但存在疗效有限、鼻刺激及非标准化等缺陷。

针灸治疗不仅可提高健康人群的嗅觉敏感性，还在帮助病毒感染后嗅觉障碍患者恢复嗅觉功能方面具有很强的潜力。如VENT 等[14]证实相较于服用维生素B 复合物，针灸治疗可使病毒感染后嗅觉障碍患者的TDI 评分由13.5 分增加至17.9 分；DAI等[15]发现针灸针刺改善11 例患者的嗅觉功能等。由于嗅黏膜的感受神经元可持续再生，人类的嗅觉神经系统具有可塑性，而针灸治疗可通过各种嗅觉元件反复刺激嗅上皮和嗅觉通路，使受损的嗅觉功能有所恢复。基于此，本研究在给予病毒感染后嗅觉障碍患者常规鼻用激素糠酸莫米松鼻喷雾剂的基础上，用针灸针刺鼻双侧内迎香穴和鼻丘穴，结果发现，联合组的TDI 评分较对照组明显增加，治愈者多了6 例，且T&T 嗅觉计测试数值变小，即病毒感染后嗅觉障碍患者的气味识别能力增强，嗅觉功能得以改善。

迄今为止，病毒感染后嗅觉障碍确切的发病机制尚不清楚，但部分学者认为病毒感染过度激发机体免疫体系，致使嗅黏膜损伤，促进嗅觉受体神经元凋亡，从而导致患者嗅觉减退乃至丧失[16]。嗅觉神经上皮位于鼻腔与外部环境接触的重要免疫屏障上，因此易受外源性损伤和内源性宿主过度防御的影响[17]。尽管嗅觉神经元及其祖细胞具有一定的再生能力，但长期的组织损伤终将导致特定的嗅觉神经上皮被呼吸道黏膜替代[18]，也就是说，病毒感染后嗅觉障碍患者可能经历嗅觉功能障碍的消长，最终嗅觉减退及丧失。在给予糠酸莫米松鼻喷雾剂治疗后，患者静脉血中CD4+CD25+T 细胞和CD4+CD25highT 细胞百分率升高，尤其是具有调节活性的CD4+CD25highT 细胞较治疗前有所增加，说明机体对病毒感染的免疫应答得到抑制。进一步给予针刺双侧内迎香穴和鼻丘穴，CD4+CD25+T 细胞和CD4+CD25highT 细胞百分率明显上调，免疫抑制调节作用加强。此外，本研究副鼻窦CT 扫描结果也同样证实机体免疫反应得以抑制。嗅裂由嗅上皮排列组成，后者含有嗅受体神经元，这些神经元的轴突在嗅球中以嗅丝和突触的形式穿过筛状板。由于病毒的侵袭，嗅裂可发生继发性炎症变化，导致黏膜水肿，随后嗅裂变窄[19]。治疗前病毒感染后嗅觉障碍患者嗅裂呈部分浑浊或完全浑浊，而给予糠酸莫米松鼻喷雾剂和针药联合均有效改善患者嗅裂通气情况，使之趋于正常及浑浊减轻。其中，针药联合的疗效显著优于传统鼻喷雾剂治疗，治愈率和改善率均较对照组明显提升。

本研究结果均表明针药联合对病毒感染后嗅觉障碍患者嗅觉功能恢复有好处，然而，其潜在的调控机制尚不清楚。TLR4 属免疫系统感受器，也是机体获得性免疫和天然免疫之间的桥梁，可激活下游MyD88/NF-κB 通路，促进细胞因子释放，从而参与炎症疾病进程[20]。既往研究证实针灸可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路减轻血管性痴呆大鼠小胶质细胞炎症[21]和创伤性脑损伤大鼠小胶质细胞、星形胶质细胞的炎症[22]，提示其有减轻神经炎症的作用。而病毒感染后嗅觉障碍正与病毒感染过度激发机体免疫体系，致使嗅觉受体神经元损伤有关。本研究中，对照组和联合组治疗4 周后静脉血中MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白相对表达量较治疗前均显著降低，且后者降幅更大，揭示TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路与之相关。但针药联合是否通过调控TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路来抑制炎症反应和改善嗅觉功能，还有待进一步在细胞动物层面对其进行验证。

综上所述，针药联合可有效减少嗅裂气流阻塞，减轻炎症反应，恢复病毒感染后嗅觉障碍患者的嗅觉功能，且该疗效与TLR4/MyD88/NF-κB 通路有关，为病毒感染后嗅觉障碍的临床治疗提供一种新的可行方案。