苯噻啶对人肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

郑江霞，束 军，汪 新，杨彩梅，沈继龙

作者单位：1安徽医科大学第四附属医院呼吸内科，合肥 2300112病原生物学安徽省重点实验室，人畜共患病安徽高校省级重点实验室，合肥 230032

肺癌是中国乃至全世界发病率和病死率均居首位的恶性肿瘤[1]，其最常见的病理类型是肺腺癌。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，是由色氨酸经过羟化和脱羧催化合成的单胺类神经递质，已被证明是多种正常细胞和肿瘤细胞培养的促有丝分裂因子，且特定的受体亚型与肿瘤的进展有关[2]。而苯噻啶是一种非选择性5-HT1、5-HT2A和5-HT2C受体拮抗剂[3]，常用于预防和治疗复发性血管性头痛。近年研究发现苯噻啶对结肠癌[4]、胃癌[5]和肉瘤[6]等有直接抑制作用，而苯噻啶对肺癌治疗的研究未见报道。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肺腺癌侵袭和转移的关键过程[7]。Wnt/β-catenin信号通路是调节肺癌细胞增殖、侵袭和迁移以及耐药的重要途径，可调节EMT进程[8]。该研究从增殖、迁移与侵袭三方面观察不同浓度苯噻啶对人肺腺癌A549和PC9细胞的影响，并初步探究其可能的作用机制是否与Wnt3a/β-catenin-EMT通路有关，以期为肺癌治疗研究的老药新用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株与药物人肺腺癌PC9细胞(货号：CL-0668)购自武汉普诺赛公司；人肺腺癌A549细胞株由安徽医科大学第一附属医院中心实验室惠赠。苯噻啶(货号：HY-B1005)购自美国MCE公司，纯度为99.73%，规格为100 mg，精密称取29.544 mg溶于1 ml DMSO，配制成0.1 mol/L浓度储备液，于-20 ℃保存，使用前室温溶解，稀释到所需浓度即可，实验组混合溶液中DMSO浓度均不超过0.1%。

1.2 主要试剂与仪器RPMI-1640培养基和DMEM高糖培养基均购自美国HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝公司；CCK-8 试剂盒(C0039)购自上海碧云天公司；青霉素/链霉素/两性霉素B溶液(100 ×) 、0.25%胰酶、RIPA裂解液均购自山东思科捷公司；Transwell小室(3422)购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自购自美国BD公司；人Wnt-3a蛋白(Wnt3a)ELISA 试剂盒(JL14159)、人β-蛋白(β-catenin)ELISA 试剂盒(JL19217)、人E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)ELISA试剂盒(JL13185)、人基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)ELISA 试剂盒(JL29650)均购自上海江莱生物公司；酶标仪购自美国Biotek公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 取出冷冻保存的A549和PC9细胞，于37 ℃水浴锅融化，用配好的A549细胞培养基(DMEM高糖培养基+10% FBS+1%青链两性霉素B混合液)和PC9细胞培养基(RPMI-1640培养基+10% FBS+1%青链两性霉素B混合液)分别复苏于细胞瓶中，在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养。视贴壁细胞的生长状态用0.25%胰酶进行消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2CCK-8增殖实验 制备单细胞悬液并计数，配成1×104/ml细胞悬液并混匀，每孔取100 μl细胞悬液，铺2块96孔板。细胞培养箱中过夜贴壁，实验组分别用细胞培养基配制的不同浓度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)溶液进行换液，细胞对照组和溶剂对照组分别用等量细胞培养基、含0.1% DMSO的细胞培养基进行换液，培养24、48 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续在培养箱中孵育1 h，用酶标仪在波长450 nm 处进行吸光度(optical density, OD)值检测并计算各组细胞活力，实验重复3次。

1.3.3细胞划痕实验 在6孔板背面划6条水平直线(每孔均匀分布3条直线)，将细胞均匀接种于6孔板中。待细胞融合度达90%以上时，用移液枪枪头在每孔中均匀划出与背面直线相垂直的两条划痕，PBS清洗干净后，实验组分别加入等量含有不同浓度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)的无FBS细胞基础培养基，细胞对照组和溶剂对照组分别加入等量无FBS细胞培养基、含0.1% DMSO的无FBS细胞培养基。0 h和24 h后在显微镜下观察和拍照，用Image J软件测定划痕面积并计算划痕愈合率，实验重复3次。

1.3.4Transwell迁移实验 将细胞均匀接种于6孔板中，待细胞融合度达80%时，实验组分别用细胞培养基配制的不同浓度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)溶液进行换液，溶剂对照组用含0.1% DMSO的细胞培养基进行换液。置于培养箱中24 h后分别收集每孔细胞并计数，用无FBS细胞培养基重悬为5×103/ml的细胞悬液。取出24孔板中的小室，在下室加入500 μl含15% FBS的细胞培养基，上室放回6孔再各接种200 μl细胞悬液，置于培养箱24 h后取出小室，经PBS洗涤、4%多聚甲醛溶液固定和0.1%结晶紫溶液染色后，用棉签拭去上室残留的细胞，在显微镜下随机选取5个视野拍照并计算穿过小室的细胞数量，实验重复3次。

1.3.5Transwell侵袭实验 在冰上将Matrigel基质胶和无FBS细胞培养基按1 ∶8稀释，取50 μl稀释液加入小室并均匀铺满，置于细胞培养箱凝固后再用无FBS细胞培养基水化备用，其余方法同1.3.4，实验重复3次。

1.3.6ELISA检测相关蛋白表达水平 将细胞均匀接种于6孔板中(3×105/孔)，待细胞融合度达80%时，实验组分别用细胞培养基配制的不同浓度苯噻啶(10、20、30、40 μmol/L)溶液进行换液，溶剂对照组用含0.1% DMSO的细胞培养基进行换液。置于培养箱中24 h后分开收集每孔细胞并计数，用无FBS细胞培养基混匀稀释各管细胞含量为1×106个，经PBS重悬后加入100 μl细胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min 离心20 min后吸取上清液，分装冻于-80 ℃冰箱备用。按照ELISA试剂盒说明书对空白组、标准组和待测组(溶剂对照组和实验组)加样和处理，用酶标仪在波长450 nm处进行OD值检测。采用ELISA法检测并计算细胞中Wnt3a、β-catenin、MMP-9和E-cad蛋白表达量，实验重复3次。

2 结果

2.1 苯噻啶抑制肺腺癌A549、PC9细胞的增殖能力与溶剂对照组相比，实验组细胞活力均下降，出现不同程度的增殖抑制现象。检测结果显示，苯噻啶作用24 h(A549：F=210.7；PC9：F=177.2)、48 h(A549：F=132.3；PC9：F=631.3)对A549和PC9细胞增殖均具有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)。与24 h相比，20、30、40 μmol/L浓度组处理48 h的抑制作用更显著，差异有统计学意义(P<0.05)；与细胞对照组相比，溶剂对照组未出现增殖抑制现象，差异无统计学意义。见图1。

2.2 苯噻啶抑制肺腺癌A549、PC9细胞的迁移能力与溶剂对照组相比，划痕实验组中不同浓度苯噻啶处理肺腺癌细胞24 h(A549：F=868.9；PC9：F=921.0)后，划痕愈合率下降，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；与细胞对照组相比，溶剂对照组对划痕愈合率影响的组间差异无统计学意义；与溶剂对照组相比，Transwell实验组中不同浓度苯噻啶处理肺腺癌细胞24 h(A549：F=474.2；PC9：F=784.6)后，迁移至下室的细胞减少，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 苯噻啶抑制肺腺癌A549、PC9细胞的侵袭能力与溶剂对照组相比，实验组中不同浓度苯噻啶处理肺腺癌细胞24 h(A549：F=354.0；PC9：F=193.2)后，侵袭至下室的细胞减少，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 苯噻啶对肺腺癌A549、PC9细胞中Wnt3a/β-catenin-EMT通路相关蛋白含量的影响ELISA法检测结果显示，苯噻啶显著降低A549和PC9细胞中Wnt3a(A549：F=534.62，P<0.05；PC9：F=534.08，P<0.05)和β-catenin(A549：F=124.51，P<0.05；PC9：F=212.22，P<0.05)的表达。苯噻啶作用于A549和PC9细胞24 h后，上皮标志物E-cad(A549：F=224.98，P<0.05；PC9：F=534.08，P<0.05)蛋白表达显著上调，而金属基质酶MMP-9(A549：F=215.96，P<0.05；PC9：F=355.48，P<0.05)表达显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。表明苯噻啶可以抑制A549和PC9细胞中的Wnt/β-catenin-EMT信号通路。见表1、2。

3 讨论

肺腺癌约占肺癌的40%，起源于小气道上皮细胞，患者被诊断时已多为晚期、发生多处转移，表现为咳嗽、咯血、胸痛和呼吸困难等症状，其治疗手段包括早期的肺叶切除术、化疗、免疫治疗和靶向治疗等。苯噻啶作为镇痛药，价格低廉且毒性小，是5-HT受体拮抗剂，且有抗组胺、抗色胺和抗毒蕈碱作用，可用于呕吐、焦虑、荨麻疹、早搏等多种病症。近两年研究发现苯噻啶对肿瘤细胞具有抑制作用：Piao et al[4]研究表明苯噻啶可通过下调Wnt信号通路来抑制结肠癌HCT116细胞的增殖和迁移能力；Jiang et al[5]研究表明苯噻啶可通过阻断Wnt/β-catenin-EMT信号通路来抑制胃癌MNK45和AGS细胞的生长、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡；Liu et al[6]发现苯噻啶可通过5-羟色胺受体1A(5-HTR1A)基因在肉瘤中发挥药物作用。综上，苯噻啶作为毒副反应明确、成本低、可及性高的临床常用药，在肿瘤治疗上的新应用具有较大的潜在价值。

图1 不同浓度苯噻啶对人肺腺癌A549和PC9细胞增殖能力的影响

表1 不同浓度苯噻啶对肺腺癌A549细胞Wnt3a、β-Catenin、E-cad、MMP-9表达量的影响

表2 不同浓度苯噻啶对肺腺癌PC9细胞Wnt3a、β-Catenin、E-cad、MMP-9表达量的影响

图2 不同浓度苯噻啶对肺腺癌A549和PC9细胞迁移能力的影响

图3 不同浓度苯噻啶对肺腺癌A549和PC9细胞侵袭能力的影响

苯噻啶对肿瘤细胞的抑制作用，可能源于它是一种5-HT受体拮抗剂。5-HT作为能影响情绪、认知和行为的单胺类神经递质可以发挥多种生物学作用，包括细胞分化和血小板聚集，其中信息传递是最重要的功能，且5-HT作为多种肿瘤细胞的生长因子，可促进多种癌细胞的增殖[9]。多项研究发现5-HT及受体对肺腺癌细胞生长发挥作用：5-HT3受体拮抗剂作为肺癌围手术期的常用止吐药对患者预后有正面作用，5-HT3受体拮抗剂还可以抑制A549细胞增殖、迁移和集落形成，其作用机制与ERK激酶途径介导的细胞自噬死亡有关，故可将其作为肺癌手术患者的首选止吐药[10]；5-HT7受体对肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭能力具有正向调节作用，其机制与上调P38/MMP-9轴通路有关，促进肺腺癌H1299细胞的迁移和侵袭则与SRC/MMP-9轴通路有关[11]；Tone et al[12]研究表明肺腺癌中5-HTR3A高表达，且与增殖标志物Ki-67表达阳性密切相关，与血清素结合介导肺腺癌细胞的促增殖作用，敲除5-HTR3A和使用5-HT3受体拮抗剂托吡司琼可抑制肺腺癌细胞的增殖。

Wnt/β-catenin信号通路是调节细胞增殖、侵袭和迁移以及肿瘤耐药的重要途径，是肺癌生长的重要调控通路，Wnt和β-catenin主要都在肺癌细胞胞质中表达[13]，除调控细胞增殖、迁移和侵袭外，β-catenin还诱导人肺腺癌的EMT进程[8]。E-cad是Wnt/β-catenin通路的下游分子，与β-catenin结合形成复合物，维持细胞极性和黏附，下调E-cad表达与肿瘤转移有关[14]。E-cad不仅是Wnt信号通路的重要成员，也是EMT关键的上皮标志物。EMT进程中，E-cad丢失导致β-catenin的核易位，细胞进行肌动蛋白重组，并通过分泌基质金属蛋白酶去除基底膜附着，β-catenin再诱导MMP-9合成，然后MMP-9完成间质胶原的切割，促使癌细胞扩散[15]。

本研究以细胞培养基稀释苯噻啶再作用于肺腺癌549和PC9细胞，实验结果揭示，苯噻啶能明显抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭行为，这种抑制效应与苯噻啶的作用浓度和作用时间有关；进一步研究显示苯噻啶给药可增加E-cad蛋白的表达，降低Wnt3a、β-catenin、MMP-9蛋白的表达：β-catenin、Wnt3a是Wnt/β-catenin信号通路中的主要蛋白表达，二者均下降表明苯噻啶可以下调Wnt/β-catenin信号通路；而E-cad蛋白和MMP-9蛋白是EMT的标志蛋白，E-cad高表达而MMP-9低表达表明苯噻啶可以抑制肺腺癌细胞的EMT进程；Wnt/β-catenin信号通路可以介导EMT进程，EMT进程是迁移和侵袭必需的细胞学形态转变，所以苯噻啶可能是通过阻断Wnt/β-catenin-EMT通路来抑制肺腺癌细胞的恶性生物学行为。

综上，在体外实验中，苯噻啶对人肺腺癌A549、PC9细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用，抑制作用的强弱依赖于苯噻啶的浓度和作用时间。其作用机制，可能包括Wnt3a/β-catenin-EMT通路的阻断。本研究仅为体外细胞实验和作用机制的初步探讨，其具体机制和靶向蛋白及交互作用还有待进一步研究。