电子鼻结合HS-SPME-GC-MS分析辐照对甲鱼预制菜挥发性风味成分的影响

徐远芳 张祺玲 黄高柳 周毅吉 郭 峰 李文革 杨常林 彭 玲，*

(1 湖南省核农学与航天育种研究所/湖南省农业生物辐照工程技术研究中心/生物辐照技术湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410125；2 长沙市农产品质量监测中心，湖南 长沙 410006；3 湖南华甲生物科技有限公司，湖南 常德 415000)

甲鱼(Pelodiscussinensis)，又称鳖、王八、水鱼等，是一种名贵的水产经济动物，主产于我国湖南、湖北、安徽、江苏等省份[1]。甲鱼肉质鲜美、营养价值高，含有丰富的氨基酸和不饱和脂肪酸等，是一种传统的营养滋补佳品[2-4]，具有抗氧化、抗疲劳[5]、抗肿瘤[6-7]等功效。由于甲鱼加工产业薄弱，我国目前市场上90%甲鱼以鲜活销售为主。对于普通消费者而言，甲鱼挑选难、宰杀难和烹饪难，是影响消费需求的重要原因[8]。预制菜因方便、快捷等优势受到消费者青睐，已成为当前消费市场新的风口，以鲜活甲鱼来加工方便快捷、营养美味甲鱼预制菜的市场潜力很大。但甲鱼预制菜因营养丰富、含水量高，在加工和贮藏过程中易受微生物污染而发生腐败变质。食品辐照作为一种安全的食品“冷巴氏杀菌”技术，已得到众多国家和国际食品组织及专业团体的认可和支持，应用前景广阔[9]。近年来，关于水产品辐照保鲜的研究已有较多报道，多集中在水产品电子束辐照研究方面，表明利用合适剂量的辐照处理能有效延长水产品的保质期，并较好地保持其原有品质[10-13]。

在辐照过程中，食品中的水辐解后所产生的·OH、 H·等活性自由基会加速脂肪、蛋白质等成分的氧化和降解，生成低分子的醛、酮类等物质，有可能导致食品风味发生变化[14-15]。研究表明，水产品经高剂量辐照处理后容易出现异味，对其感官品质产生不良影响，已成为影响辐照技术在水产品加工中应用的主要因素[16-17]。因此，利用辐照技术对甲鱼预制菜杀菌保鲜的同时，还应重点关注其风味的变化。目前，国内外关于辐照对甲鱼预制菜风味影响的研究报道尚鲜见。本试验采用不同剂量的60Co-γ射线辐照处理甲鱼预制菜，通过感官评定并利用电子鼻结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对其挥发性成分进行检测，通过对电子鼻响应值的方差分析、载荷分析(loading analysis,LA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)和线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)，并结合相对气味活度值(relative odor activity value，ROAV)评价各挥发性成分对甲鱼预制菜总体风味的贡献，探究辐照对甲鱼预制菜挥发性风味成分的影响，以期为辐照技术在甲鱼预制菜杀菌保鲜中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活甲鱼，购自湖南华甲生物科技有限公司，为湖南汉寿外塘养殖的纯种中华鳖，雄性，体重2.0±0.1 kg。鲜活甲鱼经宰杀、去内脏、去膜、去爪、切块、焯水、洗净、分装入罐、加入配料、密封，利用高压釜(121℃，103 kPa)预处理15 min，冷却后即得甲鱼预制菜，每罐净重500±25 g。

1.2 仪器与设备

PEN3电子鼻系统，德国Airsense公司；7890B-7000C-GC/MSD气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；65 μm CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；FSH-2高速分散均质机，常州市金坛友联仪器研究所；TX2202 L电子天平，日本SHIMADZ公司。

1.3 试验方法

1.3.160Co-γ射线辐照 辐照在湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所湖南辐照中心进行，放射源为60Co，放射性活度为3.14×1016Bq，单板源。采用动态步进方式辐照，辐照过程中自动换面，平均剂量率约为83.33 Gy·min-1。辐照过程使用经中国计量科学研究院国家剂量保证服务(NADS)比对标定的重铬酸银和重铬酸钾(银)剂量计(偏差<5%)进行剂量跟踪，各剂量组设3个平行。辐照剂量设定值为0、5、7.5、10 kGy，辐照剂量实测值为0、4.7、7.1、9.9 kGy。

1.3.2 感官评价 评定小组由10名经过食品感官评定培训的人员组成，分别从气味、滋味、色泽以及组织状态四个方面对甲鱼预制菜进行评分。评价前，让品评员熟悉甲鱼预制菜的感官特性，评价前后均用清水漱口，评价步骤为先闻其气味，然后在自然光下观察其色泽，再通过手触摸、手捏及对其复热后咀嚼来评价甲鱼预制菜的组织状态及滋味。甲鱼预制菜的感官评价采用5分制，具体评定标准见表1，每项评分为去掉一个最高分和一个最低分的平均分。

表1 甲鱼预制菜感官评定标准Table 1 Standards for sensory evaluation of pre-prepared soft-shelled turtle

1.3.3 HS-SPME-GC-MS检测 取甲鱼预制菜样品，剔除背壳、骨头等坚硬组织，剩余的甲鱼肉质部分用均质机打碎，混匀。样品挥发性成分的萃取方式与气相色谱-质谱联用仪(chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测条件参考贾培培等[18]的方法，准确称取甲鱼肉2.00±0.01 g，置于20 mL顶空瓶中，加盖密封，再插入65 μm CAR/PDMS萃取头，于85℃水浴下吸附40 min，取出，进样，于250℃下解吸5 min，启动仪器采集数据，每个处理平行测定3次。

色谱条件：HP-5 MS色谱柱(30 m × 250 μm，0.25 μm)；载气(He)流速1.2 mL·min-1；进样口温度250℃；初始温度40℃，保持2 min，以5℃·min-1上升至90℃，再以8℃·min-1上升至170℃，最后以 10℃·min-1上升至250℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离源；电子能量70 eV；温度250℃；扫描质量范围m/z 33～450。

1.3.4 相对气味活度值(ROAV)评价 利用ROAV法评价各挥发性成分对甲鱼预制菜总体风味的贡献大小，当ROAV≥1时，即判定该成分是甲鱼预制菜的关键风味成分；当0.1≤ROAV<1时，即判定该成分对其总体风味具有重要修饰作用。确定对甲鱼预制菜总体风味贡献最大成分的ROAVmax=100，其他各成分的ROAV按式(1)计算[19]：

(1)

式中，Cmax、Tmax分别为对甲鱼预制菜总体风味贡献最大成分的相对含量及其感觉阈值，μg·kg-1；Ci、Ti分别为其他各挥发性成分的相对含量及其感觉阈值，μg·kg-1。

1.3.5 电子鼻检测 准确称取甲鱼肉3.00±0.01 g于15 mL顶空瓶中，加盖密封，于80℃下水浴30 min，取出后放至常温。直接将电子鼻进样针头插入顶空瓶中，对其挥发性成分进行测定。该电子鼻包含由10个不同的金属氧化物传感器组成的传感器阵列，各传感器对应的特征挥发性成分见表2。

电子鼻条件：采样时间1 s/组；清洗时间120 s；归零时间10 s；样品准备时间5 s；进样流量400 mL·min-1； 分析采样时间120 s。

表2 PEN3电子鼻传感器性能描述[16]Table 2 Performance descriptions of PEN3 electronic nose sensors[16]

1.4 数据处理

对甲鱼预制菜挥发性风味成分电子鼻测定结果，利用SPSS 20.0软件中的Duncans模型对各传感器的响应值进行方差分析，并利用电子鼻自带的WinMuster软件进行LA分析、PCA分析和LDA分析。对甲鱼预制菜挥发性成分的GC-MS测定结果，通过计算机检索与标准谱库NIST11相匹配，仅报道相似度≥80的鉴定结果，按峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对百分含量，计算结果以3次平行测定的平均值计[16]。

2 结果与分析

2.1 辐照前后甲鱼预制菜的感官评分结果

不同剂量辐照后甲鱼预制菜的感官评分结果见图1。结果表明，对照组(0 kGy)甲鱼预制菜固有气味和鲜味浓郁，无异味，外观颜色正常，背面呈深灰色，腹面呈乳白色，光泽度好，肉质紧实，裙边坚实且富有弹性。与对照组相比，4.7 kGy组的气味、滋味、色泽和组织状态变化不显著(P>0.05)，表明4.7 kGy辐照处理不会对甲鱼预制菜的感官品质产生显著影响。随着辐照剂量的增加，7.1和9.9 kGy组会产生轻微的异味，但仍具有甲鱼肉的固有气味和鲜味，其色泽和组织状态均无显著变化(P>0.05)。综合感官评分结果认为，5 kGy以内剂量辐照对甲鱼预制菜的感官品质影响不大，高于5 kGy时可能会影响其气味和滋味，进而导致产生异味。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.图1 不同剂量辐照后甲鱼预制菜的感官评分结果Fig.1 Sensory evaluation result of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.2 辐照前后甲鱼预制菜的电子鼻响应值

电子鼻各传感器对不同剂量辐照后甲鱼预制菜挥发性风味成分的响应值见图2。结果表明，对照组电子鼻传感器S2、S6、S8、S9的响应值较高，其中S9的响应值最高，说明该传感器对甲鱼预制菜挥发性气味的响应最强，其他各传感器对甲鱼预制菜气味的响应较低，说明其对样品气味检测的贡献较小。与对照组相比，传感器S2、S6、S8和S9对4.7、7.1、9.9 kGy组的响应值均发生显著变化(P<0.05)，随着辐照剂量增加呈先减小后增大的趋势。

2.3 辐照前后甲鱼预制菜电子鼻响应值的LA

不同剂量辐照后甲鱼预制菜特征气味响应值的LA结果见图3。传感器S9对PC1的贡献率最大，其次是S2、S6。传感器S6对PC2的贡献率最大大，S8次之，且辐照前后样品PC1、PC2的主要贡献传感器保持不变。因此，电子鼻对甲鱼预制菜中芳香成分和有机硫化物、氮氧化合物、甲烷、醇类和醛酮类物质较为敏感，这些成分对风味的贡献较明显。

图2 电子鼻传感器对不同剂量辐照后甲鱼预制菜的响应值雷达图Fig.2 Radar chart of electronic nose sensor responses of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.4 辐照前后甲鱼预制菜电子鼻响应值的PCA

由图4可知，PC1的贡献率为94.16%，PC2的贡献率为5.25%，两者累积贡献率为99.41%，2个主成分能很好地反映样品的整体信息。图中各组样品互不重叠，整体区分度较好，说明PCA方法适用于对不同剂量辐照后甲鱼预制菜挥发物的分析。4.7 kGy组与对照组在PC1上未能完全分开，说明两者风味整体差别较小。7.1和9.9 kGy组与对照组在PC1上距离相对较大，说明其风味存在一定差异。因此，辐照前后甲鱼预制菜挥发物的差异与辐照剂量有关，且主要体现在PC1上。

图3 不同剂量辐照后甲鱼预制菜电子鼻响应值的LA图Fig.3 LA of electronic nose response values of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

图4 不同剂量辐照后甲鱼预制菜电子鼻响应值的PCA图Fig.4 PCA of electronic nose response values of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.5 辐照前后甲鱼预制菜电子鼻响应值的LDA

由图5可知，PC1的贡献率为75.25%，PC2的贡献率为15.30%，两者累积贡献率为90.55%。图中各组样品均无重叠，区分明显，说明LDA能对不同剂量辐照后甲鱼预制菜的挥发物进行有效区分。4.7 kGy组与对照组距离较近，7.1和9.9 kGy组与对照组距离相对较远，说明7.1和9.9 kGy组与对照组的差异大于4.7 kGy组，表明高剂量辐照对甲鱼预制菜的挥发物影响较大，这与PCA结果相符。

图5 不同剂量辐照后甲鱼预制菜电子鼻响应值的LDA图Fig.5 LDA of electronic nose response values of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.6 辐照前后甲鱼预制菜挥发性成分分析

不同剂量辐照后甲鱼预制菜挥发性成分的组成不同，结果见表3。0、4.7、7.1、9.9 kGy组分别鉴定出56、66、66和61种挥发性成分。对照组挥发性成分以醛类为主，其次为烃类、醇类、含氮含硫及杂环类。与对照组相比，辐照后样品醛类相对含量明显降低，减少的主要成分是己醛、苯甲醛和辛醛，苯乙醛相对含量则增加；烃类、芳香族类相对含量增加，含量增加的烃类有十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、戊基环乙烷和姥鲛烷等；辐照后样品均检测出环十五烷、6,9-十七二烯、8-十七烯等新物质。辐照前后样品中芳香族类差异明显，辐照后产生多种新的苯和萘类化合物，酮类和酯类相对含量增加，并检测出5-甲基-2-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮、乙酸丁酯以及甲酸(E)-9-十四烯-1-醇酯等新物质。随着辐照剂量的增加，含氮含硫及杂环类相对含量先降低后增加，发生变化的主要成分为2-戊基呋喃和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮；醇类相对含量整体变化不大，但辐照后1-辛烯-3-醇相对含量明显降低，十四醇相对含量明显增加。辐照后酸类相对含量降低，减少的主要成分是2-甲基戊酸酐，油酸和反油酸均未检出，而棕榈酸相对含量则增加。说明辐照处理对甲鱼预制菜挥发性成分组成产生影响，进而可能导致其风味发生变化。

表3 不同剂量辐照后甲鱼预制菜挥发性成分的相对含量Table 3 Relative content of volatile compounds in pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses /%

表3(续)

表3(续)

2.7 辐照前后甲鱼预制菜挥发性成分的ROAV分析

挥发性成分对甲鱼预制菜气味的贡献大小由含量和感觉阈值共同决定[23]。甲鱼预制菜中壬醛的相对含量较高，且感觉阈值较低，对样品总体风味的贡献最大。以壬醛ROAV为100，计算其他各挥发性成分的ROAV，其中ROAV≥0.1的挥发性成分见表4。对照组甲鱼预制菜中关键风味成分为壬醛、癸醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛和2-戊基呋喃。辐照后辛醛、己醛、1-辛烯-3-醇的ROAV降低，说明辐照处理降低了辛醛、己醛、1-辛烯-3-醇对样品总体风味的贡献率，其中1-辛烯-3-醇的ROAV随辐照剂量增加而逐渐降低。随着辐照剂量的增加，庚醛、2-戊基呋喃的ROAV先降低后增加。对照组中苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛对甲鱼预制菜风味具有重要修饰作用，辐照后苯乙醛的ROAV增加，成为关键风味成分。

表4 不同剂量辐照后甲鱼预制菜中挥发性风味成分的ROAVTable 4 ROAV of volatile flavor compounds in pre-prepared soft-shelled

3 讨论

辐照在杀菌的同时会对肉品的风味产生重要影响，可能使其产生令人不愉快的异味[24]。利用电子鼻技术检测肉品的特征气味，可对不同剂量辐照处理肉品气味轮廓进行快速区分[25-26]。本研究中，甲鱼预制菜感官评价结果表明，4.7 kGy组与对照组相比无明显差异，7.1和9.9 kGy组会产生异味，说明高于5 kGy剂量辐照处理会对甲鱼预制菜的气味和滋味产生明显影响。甲鱼预制菜辐照前后电子鼻特征气味的响应值发生明显变化，但发生变化的主要挥发性风味成分类别均为芳香成分和有机硫化物、氮氧化合物、甲烷、醇类和醛酮类化合物。利用PCA和LDA可对不同剂量辐照处理的甲鱼预制菜进行有效区分，4.7 kGy组与对照组的气味特征接近，而7.1、9.9 kGy组与对照组差异相对较大，说明7.1、9.9 kGy辐照后甲鱼预制菜的气味特征发生了明显变化，这与感官评价试验结果一致。因此，5 kGy以内剂量辐照处理对甲鱼预制菜挥发性风味的影响不大，高于5 kGy剂量辐照可能对其挥发性风味成分产生影响并产生异味，这与前人研究辐照保鲜对水产品挥发性风味成分的影响所得出的结论相似。如杨文鸽等[15]研究表明低于5 kGy辐照后能较好地保持美国红鱼肉的原有风味，7、9 kGy时异味明显；梅卡琳等[16]研究也表明经5 kGy及以下剂量辐照后蟹肉能较好地保持其原有嗅感，7和9 kGy辐照会导致轻微异味产生；瞿桂香等[17]、陈东清等[27]分别证实7和8 kGy及以上剂量辐照会使小龙虾产生明显的辐照异味。目前，关于肉品辐照后异味的形成机理已有较多报道，研究表明肉品的辐照异味主要来源于脂质氧化分解[28]和含硫氨基酸分解[29]所产生的异味成分。脂质的氧化与脂肪酸的不饱和程度密切相关，不饱和脂肪酸经辐照后所生成的自由基和氢过氧化物易攻击氨基酸侧链，产生挥发性羰基类化合物[30]。甲鱼中不饱和脂肪酸和氨基酸含量高，使其在辐照杀菌过程中更容易发生氧化并进而产生异味，导致辐照后甲鱼预制菜的挥发性风味发生变化。

HS-SPME-GC-MS分析结果表明，不同剂量辐照后甲鱼预制菜挥发性成分的种类增多。醛类相对含量最高，壬醛、癸醛、辛醛、己醛、庚醛是其关键风味成分。醛类感觉阈值较低，对其风味起主要贡献。辐照会诱发脂类氧化，生成低分子醛、酮类等物质，这类物质很可能是产生“辐照味”的主要因素[20]。辐照后醛类总相对含量降低，降低的醛类主要有己醛、苯甲醛、辛醛，而苯乙醛则增加，庚醛先降低后增加。酮类相对含量较低，辐照后酮类相对含量增加，新检测出6-甲基-2-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮。辐照后烃类相对含量明显增加，新产生环十五烷、6,9-十七二烯和8-十七烯。烷烃类阈值较高，对风味直接贡献较小，而烯烃类可作为前体物质形成醛、酮类等[31]。醇类阈值一般较高，对整体气味的贡献较小[32]。醇类中1-辛烯-3-醇相对含量最高，且阈值较低，是甲鱼预制菜的关键风味成分，被认为与新鲜鱼的香气有关[20,31]。本研究发现，随着辐照剂量增加，1-辛烯-3-醇相对含量逐渐降低，这与杨文鸽等[21]的研究结果相似，被认为与高剂量辐照后梅鱼鱼糜凝胶香味变淡、略有异味有关。一些含苯环物质具有不良气味，如甲苯、萘等，不同剂量辐照后芳香族类相对含量增加，其中，7.1、9.9 kGy组检测出甲苯等物质，可能是辐照后甲鱼预制菜产生异味的主要原因之一[16]。含氮含硫及杂环类物质阈值较低，是重要的风味物质。辐照后含氮含硫及杂环类物质先降低后增加，主要变化的成分是2-戊基呋喃和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。普遍认为2-戊基呋喃是亚油酸的一种氧化产物，具有肉焦香味以及泥土、青草和类似蔬菜的香气，其阈值较低，对肉品风味贡献较大[33-34]。7.1、9.9 kGy组中2-戊基呋喃相对含量增加，表明高剂量辐照会促进脂质的氧化。此外，六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮相对含量也明显增加，但其气味特征及对风味的影响尚不明确。辐照后酸类总相对含量降低，减少的主要成分是2-甲基戊酸酐，油酸和反油酸均未检出，而棕榈酸相对含量则增加。酸类阈值较高且挥发性较低，对形成肉香味具有不可忽视的基底作用[35]。辐照后酯类相对含量增加，新产生乙酸丁酯和甲酸(E)-9-十四烯-1-醇酯。酯类能增强其他风味化合物的气味，起着浓郁而柔和的基底作用[16]。

4 结论

经4.7 kGy辐照后，甲鱼预制菜的整体风味无明显变化，但7.1、9.9 kGy辐照会对其风味产生明显影响，进而产生异味。利用电子鼻检测结合PCA、LDA可有效区分不同剂量辐照处理的甲鱼预制菜，4.7 kGy组与对照组气味特征接近，7.1、9.9 kGy组与对照组差异相对较大。甲鱼预制菜辐照前后特征气味的差异主要表现在芳香成分和有机硫化物、氮氧化合物、乙醇、醇类和醛酮类物质。不同剂量辐照后甲鱼预制菜挥发性成分的种类增多，关键风味成分为壬醛、癸醛、辛醛、己醛、庚醛1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃，苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛对其风味具有重要修饰作用。辐照后辛醛、己醛、1-辛烯-3-醇对风味的贡献率降低，庚醛、2-戊基呋喃的贡献率先降低后增加，苯乙醛的贡献率增加并成为关键风味成分。因此，利用60Co-γ射线辐照对甲鱼预制菜进行杀菌，剂量低于5 kGy时不会对其挥发性风味产生明显影响。