见血青茎段腋芽诱导培养条件筛选

陈吉裕

（重庆三峡职业学院，重庆万州 404155）

1 材料与方法

1.1 试验材料

见血青采自四川省达州市宣汉县（E107.72°，N31.35°），将整个植株连根带土挖取，用苔藓包裹根际土壤，置于纸箱中带回，并用泥炭土∶蛭石=1∶1 混合均匀带土栽培保存。经重庆三峡医药高等专科学校重庆三峡中药研究所副所长付绍智副教授鉴定为兰科（Orchidaceae）羊耳蒜属（）植物脉羊耳兰的鲜株。

1.2 外植体消毒

选用生长旺盛、长势基本一致的见血青新鲜植株，自来水冲洗10～15min，去掉根、叶片及茎表面残留老叶等，用洗洁精溶液轻轻刷洗茎秆表面，再用自来水冲洗干净，用吸水纸吸干。在超净工作台上，将外植体放入灭菌瓶，加入75%酒精，淹没材料即可，摇晃10s，去掉酒精。以正交试验L9（34）为消毒处理，共9 个处理，即用0.1%HgCl2、农用链霉素2000 倍液、甲基硫菌灵800 倍液、新洁尔灭10 倍液，按表1 具体消毒方法进行，消毒液用量为材料的2 倍，各加1 滴吐温-80，盖上瓶盖摇晃相应时间，使之充分接触。打开瓶盖，去掉消毒液，摇晃2min，弃去液体，重复清洗5～6 次，用无菌纸吸干。将消毒后茎段接种至腋芽诱导初始培养基（1/2MS 培养基）中，每个消毒处理接种10 瓶，每个处理重复4 次且接种约15 株植株的茎，接种后放入25℃培养室培养，每天光照16h，光照强度为3000Lx。培养15d 后统计外植体污染率和褐变率。

1.3 腋芽诱导培养

以植物激素6-BA、花宝1 号、马铃薯泥、香蕉泥为试验因素，设计正交试验L16（45）（见表2），共16 个处理配制腋芽诱导培养基，添加30g/L，琼脂7g/L，pH 值均为5.8，121℃灭菌20min，自然冷却，备用。

表2 培养基不同成分配比对茎段腋芽诱导的影响

将以1.2 中筛选出的消毒方法消毒后的茎切割成1～2cm 长茎段，要求每个茎段至少带1 个节。将茎段接种至腋芽诱导培养基中，每瓶接种1 个茎段，每个茎段插入培养基2～3mm。每个培养基处理接种10 瓶，每个处理重复5 次，接种后放入25℃培养室培养，每天光照16h，光照强度为3000Lx。培养30d 后统计腋芽诱导率、死亡率。

1.4 数据处理与分析

采用PDS 数据处理系统V9.01 对实验数据进行方差分析和多重比较。

污染率（%）=（污染的外植体数／接种外植体数）×100

褐变率（%）=（褐变的外植体数／接种外植体数）×100

诱导率（%）=（腋芽萌发的外植体数／接种外植体数）×100

发芽率（%）=（芽数／接种茎段总数）×100

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对茎段消毒效果的影响

以0.1%HgCl2、新洁尔灭10 倍液和农用链霉素2000 倍液为消毒剂，通过正交试验，由表1 可知，当使用0.1%HgCl2消毒处理9min，再用新洁尔灭10 倍液消毒处理15 min，最后再使用农用链霉素2000 倍液处理20 min 时，消毒效果最好，污染率仅为8.33%，褐变率也相应最低为30%。从污染率而言，0.1%HgCl2对其影响最大，其次为新洁尔灭10 倍液，农用链霉素2000倍液影响最小；从褐变率而言，0.1%HgCl2对其影响最大，2000 倍农用链霉素和新洁尔灭10 倍液影响均很小，不明显。因此，0.1%HgCl2对见血青茎段消毒效果影响最大，但由于HgCl2的毒害作用，随着其消毒处理时间的增加，褐变率也随之增加。

表1 不同消毒处理对茎段消毒效果比较

2.2 不同培养基对腋芽诱导的影响

3 结论与讨论

3.1 结论

由最佳消毒方式消毒后，将至少带1 个节的茎段接种至不同物质配比的培养基中。由表2 可知，当6-BA 添加量为2.0mg/L、花宝1 号添加量为1.5mg/L、马铃薯泥添加量为10g/L、香蕉泥添加量为5g/L 时，见血青茎段腋芽诱导率最高为96%，发芽率也最高为138.00%。发芽率高于100%的原因是部分茎段每节萌发1 个侧芽（图1A），而部分茎段节可萌发2～3 个侧芽（图1B 和C），特别是顶端和底端，节间短，常见萌发2～3 个侧芽。在见血青茎段侧芽诱导率上，6-BA＞香蕉泥＞马铃薯泥＞花宝1 号；在茎段侧芽发芽率上，6-BA＞香蕉泥＞花宝1 号＞马铃薯泥。总体而言，6-BA 和香蕉泥对茎段侧芽萌发的影响较大，其中6-BA 影响最大。

图1 茎段侧芽诱导结果

适宜见血青茎段的消毒方法为：0.1%HgCl29min+新洁尔灭10 倍液15min+农用链霉素2000 倍液20min，污染率为8.33%，褐变率为30%；促进茎段腋芽诱导的培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+1.5g/L 花宝1 号+10.0g/L 马铃薯泥+5.0g/L 香蕉泥，腋芽诱导率为96%，发芽率为138.00%。

3.2 讨论

茎段是见血青组培快繁常选用的外植体[1-2]，诱导腋芽萌发是见血青茎段增殖扩繁的关键环节。影响腋芽萌发的主要因素包括取材时期、植株生理状态、培养基和消毒效果。造成污染的原因有很多，常见的如环境污染引起，超净工作台过滤装置失效，培养基及器皿灭菌不彻底，外植体本身带菌等。造成污染的病原主要为细菌、真菌、内源菌。在整个组培过程中，最难处理的就是内源菌污染，即由于外植体材料内部（细胞内或细胞间）携带的微生物（如内生细菌、真菌等），在用消毒剂处理过程中不能被一般的表面消毒方法所清除，在培养过程中从外植体内部滋长。兰科植物根部本身携带众多内生真菌[2-3]，易引起组培污染。常见的对策为：改进外植体消毒方法，如利用多种消毒剂间隙消毒、使用抗生素等。试验中使用HgCl2、新洁尔灭、农用链霉素对见血青的消毒有明显的效果，污染率为8.33%。

马铃薯、香蕉等有机添加物是兰科植物组织培养中常用的有机添加物。它们含有氨基酸、矿物质、维生素和碳水化合物等成分，这些成分对细胞的增殖和培养物的生长有明显的促进作用。天然有机物的添加对兰科植物的组培有明显促进作用，常见的有马铃薯汁、椰子汁和香蕉汁等[1,4-6]。何官榕等[1]研究发现，添加香蕉汁、马铃薯汁有利于见血青不定芽诱导和增殖；王加文等[4]研究表明，对紫花羊耳蒜原球茎生长的效果椰乳＞香蕉汁＞马铃薯汁。本研究中椰汁、香蕉汁对侧芽萌发均有明显影响。