医药化工废水降解菌的分离及菌群分析

周旭华，苏 悦

（1.长治职业技术学院，山西 长治 046000；2.杭州秀川科技有限公司，浙江 杭州 311121）

0 引言

天然和人工合成品的甾体激素，均具有环戊烷骈多氢菲母核。废水中主要污染物为稠环的杂环有机物，吡啶及吡啶盐含量较多。甾体激素制药废水具有浓度高、生化性差、生物抑制性高等特点，处理难度较大。生物法具有处理成本低、降解具有特异性和无二次污染等优势，目前报道的甾体制药废水高效降解菌株主要有假单胞菌属（psudomonas sp.）、醋酸杆菌属（Acetobacter sp.）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）、红球菌属（Rhodococcus sp.）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium sp.）等[1-5]。

本实验室已经进行了大量医药化工废水生物处理的相关研究。本研究拟从甾体激素制药废水的生物处理系统物种分布情况，探究有效降解甾体制药废水的可能物种组成，为同类废水工程应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品来源于湖南某生物制药公司甾体激素医药原料生产废水的生化处理系统。菌株分离自曝气池混合液，高通量测序样品来源于曝气池的活性污泥。该处理系统已经稳定运行约9个月，曝气池运行温度约为45℃。曝气池的进水水质基本情况如下：COD 26 876 mg/L，NH3-N 297 mg/L，TP 5.8 mg/L，盐度2.56%，pH 7.0。采样时间为2019年10月14日，4℃冷藏。分离出的菌株由杭州秀川科技有限公司实验室保存。

1.2 培养基

LB液体培养基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。121℃灭菌20 min。

LB固体培养基：1 L的LB液体培养基加入20.0 g琼脂。121℃灭菌20 min。

1.3 菌株分离纯化

菌株分离：采用梯度稀释涂布法，将富集液梯度进行稀释，随后取各梯度的样品0.1 mL，用无菌的玻璃涂布棒均匀涂布到LB固体培养基上，分别在30℃和50℃培养箱内倒置培养，定期观察，直至出现明显的单菌落[6]。

菌株纯化：挑取形态不同的单菌落至无菌的LB固体培养基上，多次画线，得单菌落。

1.4 形态学特征

菌落形态：观察平板上菌落培养1～3 d后的形状、大小、颜色、边缘、透明程度和突起等。

1.5 DNA提取

取菌液1 mL，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，加100 μL无菌的MilliQ级水重悬菌体；煮沸30～40 min；放-20℃环境2 h以上；12 000 r/min离心5 min，上清液备用。

1.6 PCR扩增

引物1：27F（5′-GAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）。

引物2：1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3′）扩增16S rDNA。扩增体系为PCR mix：12.5 μL，引物1：0.5 μL，引物2：0.5 μL，无菌的MilliQ级水：10.5 μL，DNA模板：1 μL。扩增程序：25 μL反应体系35个循环；变性：98℃，5 s；退火：55℃，10 s；延伸：72℃，25 s。

1.7 序列分析

将分离纯化得到的菌株PCR扩增产物直接送交杭州擎科生物技术有限公司进行序列测定，16S rDNA序列提交至EzBioCloud数据库进行序列比对。污泥样品直接送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行高通量宏基因组微生物测序。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

从样品中分离纯化的14株菌株，大部分可以在中等盐浓度的培养基中生长。其中KR1和KR4在50℃培养分离，其余在30℃培养分离。

2.2 形态学特征

菌落呈白色或乳白色，其中白色菌落居多。菌落呈圆形，培养1～3 d后，直径为1～4 mm；表面光滑或粗糙；大多数不透明，少数半透明或透明（表1）。

表1 部分分离菌株的形态学特征

2.3 测序结果

通过高通量宏基因组微生物测序共得到去除嵌合体与靶区域外后的序列数68 286条，根据结果表明，污泥样品中微生物主要分布在5个属，分别为贪铜菌属（Cupriavidus sp.）53.68%，无色杆菌属（Achromobacter sp.）30.67%，橄榄形菌属（Olivibacter sp.）7.23%，伊 丽 莎 白 菌 属（Elizabethkingia sp.）2.78%，嗜染料菌属（Pigmentiphaga sp.）1.79%（图1）。

图1 属水平丰度

图1为样品内物种丰度，丰度前13的物种按不同的颜色标出。

对从样品中分离纯化的菌株中挑选有代表性的14个菌株进行16S rDNA序列测定，并提交至EzBioCloud数据库进行比对，14个菌株分布在5个属，其中芽孢杆菌属（Bacillus sp.）6株，伊丽莎白菌属（Elizabethkingia sp.）2株，无色杆菌属（Achromobacter sp.）2株，假单胞菌属（Pseudomonas sp.）3株，鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium sp.）1株（表2）。

表2 菌株16S rDNA序列的BLAST比较结果

2.4 基于COG的功能分析

通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后，获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成（图2）。

图2 功能预测丰度

3 结语

16S rDNA常用于生物物种的分子进化分析，序列分析结果表明，在生物降解甾体激素制药废水中起作用的可能菌群包括贪铜菌属（Cupriavidus sp.）、无色杆菌属（Achromobacter sp.）、橄榄形菌属（Olivibacter sp.）、伊丽莎白菌属（Elizabethkingia sp.）、嗜染料菌属（Pigmentiphaga sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobˉacterium sp.）等。假单胞菌属（psudomonas sp.）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium sp.）与已有报道处理同类废水菌群相同[1，3]。鞘氨醇杆菌属（Sphingobium）是一类具有很强的烷烃、杂环芳香烃降解能力的革兰氏阴性细菌。陆源源[7]也从城市污水处理厂获得高效降解甾体雌激素的鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium sp.）菌株。

曝气池混合液梯度稀释涂布平板在50℃下培养2 d主要生长芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。在30℃下培养分离纯化得到菌株较为丰富，包括伊丽莎白菌（Elizabethkingia anophelis）、无色杆菌（Achromobacter anxifer）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）、嗜热鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium thermophilum）。高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）KR1和特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）KR4可以在50℃下较好生长。周旭华等[8]从高盐环境中筛选的一株嗜耐盐菌株高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），能高效降解吡啶。孙智毅[9]从焦化废水中分离出一株具有高效异养硝化-好氧反硝化的贪铜菌属（Cupriavidus sp.）菌株。孙福艳等[10]从烟草工业废水处理厂的污泥中筛选出一株不动杆菌属（Acinetobacter sp.）甾体雌激素降解菌株，能以雌酮为底物。高通量测序和可培分析之间不能完全对应，可能与采用的培养基和培养条件有关，也可能与人工挑选菌落遗漏有关，也可能与高通量测序样品污染有关，需进一步确认。