藻类对大型溞抵抗农药的毒理学影响及其机制

何 妍,石琬绮,彭鑫鑫,杨 巍,李锗镡,文 昕,罗竣潇,刘华祖,李 伟,2*

藻类对大型溞抵抗农药的毒理学影响及其机制

何 妍1,石琬绮1,彭鑫鑫1,杨 巍1,李锗镡1,文 昕1,罗竣潇1,刘华祖1,李 伟1,2*

(1.重庆大学环境与生态学院,重庆 400045；2.三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400045)

为探究藻类对大型溞农药抗性的影响及其机制,分别将5种淡水广布的甲藻、硅藻、绿藻、隐藻、蓝藻等量培育大型溞后,再将大型溞分别暴露于2种杀虫剂吡虫啉(水溶性)和氰戊菊酯(脂溶性)中,测定大型溞的半数致死剂量、化学计量比(P/C,N/C)和脂肪酸含量.研究表明:与生源性化学元素氮磷相比,N3不饱和脂肪酸能更好揭示大型溞对藻类的捕食关系;藻类的N3不饱和脂肪酸含量是影响大型溞对水溶性农药抗性的关键因子;大型溞对脂溶性农药的抗性差异比暴露在水溶性农药中更明显.因此,藻类的N3不饱和脂肪酸是预测大型溞对水溶性农药抗性强度的最佳因子,其有助于更准确地预测以不同藻类为食的大型溞食物链对自然环境中污染物的抗性和风险.

藻类；大型溞；氰戊菊酯；吡虫啉；生态毒理学；营养级联

新烟碱类杀虫剂和菊酯类杀虫剂频繁在生态系统中被检测出,造成了生物多样性的下降[1-6].甚至有研究发现水生生态系统受到新烟碱杀虫剂的高毒性和持久性的威胁,不仅改变其食物网的结构,还影响到更高层次的消费者,在“营养级联效应”作用下,对生态环境造成不可逆转的负面影响[7-8].菊酯类杀虫剂由于亲脂性和和持久性易残留富集在生物体中,对生物的生殖系统和神经系统均有负面影响,对水生环境造成潜在的高度生态风险[9-10].目前大量研究主要侧重于从光照、温度、食物数量等环境胁迫因子角度关注大型溞对农药抗性的变化,而缺乏对食物质量的毒理学影响研究.例如Delnat等[11]研究发现日温变化会放大有机磷和杀菌剂组成的农药混合物的毒性;Naeem等[12]研究了食物数量能影响氰戊菊酯杀虫剂对大型溞的毒性.然而,食物质量对于生物种群来说却是一个关键的环境限制因素[13-14],特别是从化学计量比和不饱和脂肪酸角度分析食物对大型溞抗性影响的研究还鲜见报道.

化学计量比是生态计量学的核心,目前主要集中在碳(C)、氮(N)、磷(P)这3种生命化学基础元素[15].食物网内生物体的化学计量比能够反映元素流动循环状况;当生物体受外界环境干扰导致体内化学计量比不平衡、不匹配也会影响其生长速率、竞争和繁殖,最终影响食物网的物质循环和能量流动[16].目前,人类频繁活动带来的氮磷等营养盐进入水生生态系统,将改变其化学元素的组成占比,从而影响水生食物网生产者和消费者的化学计量关系[17-19],水生生态系统生物的生态化学计量学对污染物的响应也需引起重视.

脂肪酸作为生物膜的基本组成部分,是最常见储存和循环能量的形式,也参与调节多种生物活动[20-21].其中N3不饱和脂肪酸主要包括十八碳三烯酸 (ALA)、二十碳五烯酸 (EPA)和二十二碳六烯酸 (DHA),ALA是构成脑细胞膜、神经递质、突触,神经递质受体结构的主要成分,通过脱氢和延长碳链合成EPA和DHA,两者有利于维持神经细胞膜的完整性和流动性,还具有促进脑细胞生长,增强大脑机能等作用[22],N3不饱和脂肪酸是构成细胞膜结构的磷脂主要成分,在生物体内具有稳定细胞膜,增强免疫力等重要生理功能.由于N3不饱和脂肪酸易被氧气氧化,且氧气在水中扩散速度比在空气中慢,使得水生生态系统的初级生产者群落含有丰富的N3不饱和脂肪酸,而在多数陆生植物中很难检测到.因此水陆生态系统食物链的第一营养级可用性存在差异,进一步导致消费者的营养摄取不平衡从而影响其生长与繁殖[23-25],N3不饱和脂肪酸在自然界中主要存在于海洋原生物和藻类,通过食物链传递给更高营养级的鱼类等[26-29],目前研究多偏向通过现代生物技术将其应用于保健品、食品和药品等领域从而改善人体的健康[22].

本研究选取5种自然水体常见的淡水藻类(甲藻、硅藻、绿藻、隐藻、蓝藻)喂养大型溞,分别暴露在目前广泛使用的杀虫剂吡虫啉(水溶性)和氰戊菊酯(脂溶性)中,以探究食物质量对大型溞的抗性影响; 从化学计量比和不饱和脂肪酸角度分析藻类种群引起的大型溞对农药抗性产生差异的影响机制.研究将有助于了解高营养级水生生物对农药抗性的作用规律,也对阐明对水生生态系统食物网的影响机制具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 藻种和大型溞的培养

绿藻门蛋白核小球藻(),硅藻门小环藻(sp.),隐藻门隐藻(sp.),甲藻门楯形多甲藻 (),蓝藻门钝顶螺旋藻()均购于中国科学院淡水藻种库,蛋白核小球藻采用BG11培养基,小环藻采用CSI培养基,隐藻采用AF6培养基,楯形多甲藻不等变种采用119培养基,钝顶螺旋藻采用Spirulina 培养基,在光照75μmol/ (m2·s)、光暗比14h:10h,温度25℃的条件下无菌培养至对数生长期,通过沉淀和离心浓缩去除培养基,取下层藻液作为大型溞的食物备用.

本研究采用的大型溞()是一种浮游动物枝角类生物,且被广泛用作指示生物评价水体环境中各种有害化学物质的生物毒性[30].实验前期用孤雌生殖法获取大型溞单克隆纯品系[31],将其产下的三代及以上的子代作为实验对象分别喂食5种藻,在自然光照条件下饲养1个月以上,饲养温度(20±1)℃,光暗周期16h:8h,自来水曝氧48h以上作为培养介质.

1.2 毒性试验

选用的农药为水溶性的吡虫啉(纯度为95%,CAS:138261-41-3)和脂溶性的顺式氰戊菊酯(纯度为95%,CAS:66230-04-4),购于上海源叶技术有限公司.建立交叉因子设计进行亚慢性毒性试验,通过预实验分别确定农药浓度梯度,共设置7个浓度,5个实验组,每个浓度设5个平行组,即吡虫啉(0,0.5,1,2,10,25,50mg/L)×5种藻(甲藻、硅藻、绿藻、隐藻、蓝藻),氰戊菊酯(0,0.0001,0.001,0.01,0.1,0.2, 1μg/L)×5种藻(甲藻、硅藻、绿藻、隐藻、蓝藻).实验期间采用COMBO培养基[32]配制试验溶液,为使脂溶性的氰戊菊酯混合均匀,加入0.02%的二甲基亚砜(DMSO),比最低的可观察有效浓度(2%)低2个数量级[33],并且低于OECD建议的溶剂限度.每个平行组用100mL的烧杯装80mL试液,放15只4～5d的大型溞,每隔1d喂食1mgC/L的藻液,烧杯表面采用保鲜膜包裹防止农药挥发,每24h记录大型溞存活情况并将幼溞取出,每隔7d更换暴露溶液,暴露时长为14d.

1.3 测定项目及方法

化学因子的测定:各取50mL培养藻液和以此为食物的大型溞100只冷冻干燥作为样品,称重,使用固体燃烧法在总有机碳分析仪(TOC-SSM5000,日本岛津)中测定5种藻类和大型溞的总有机碳含量.用于测总氮、总磷含量的样品用浓硫酸和30%过氧化氢在消煮炉中高温消解,待溶液冷却并定容,总磷含量用钼锑抗分光光度法测定,总氮含量用总有机碳分析仪测定(TOC-L,日本岛津);再根据测定的各样品碳、氮、磷含量计算出3个元素的化学计量比值,即碳氮比、碳磷比和氮磷比[34-35].

脂肪酸的测定:采用一步法分析测定藻和大型溞的脂肪酸含量[36-37],将样品冷冻干燥24h以上,依次加入4mL正己烷,1mL内标液(1mg二十三烷酸溶于100mL正己烷中)和2mL14%三氟化硼.在100℃下水浴加热120min使其衍生化,再依次加入1mL正己烷和2mL超纯水.离心后取上层液相氮吹至干,浓缩于200μL正己烷,采用气相色谱/三重四级杆质谱联用仪(GCMS-TQ8040,日本岛津)定性定量分析样品的脂肪酸,配备SH-Rxi-5SilMS色谱柱, (30m´0.25mm,0.25mm,日本岛津);通过比较样品中脂肪酸的峰面积与内标的峰面积,估算脂肪酸浓度如下:

式中:S是样品中某一脂肪酸的色谱峰面积;IS是内标(二十三烷酸)的色谱峰面积;IS是内标的浓度(mg);S是样品的重量(g).

在所测定的37种脂肪酸当中,二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、十八碳三烯酸(ALA)在初级生产者和消费者的碳转移中有至关重要的作用,因此,在本研究中,脂肪酸的分析集中在这些不饱和脂肪酸种类含量上[38].

1.4 数据处理与分析

采用Logistic模型分别计算大型溞暴露在氰戊菊酯和吡虫啉的LC50值.以大型溞LC50为因变量,以碳氮比、碳磷比、N3不饱和脂肪酸含量为自变量,采用线性混合效应模型(LMM)来评估与大型溞LC50相关的因素.采用R4.0.3软件ANOVA程序进行数据显著性差异分析,以=0.05作为统计学检验的显著性水准.所有统计分析均在R4.0.3版本中进行.

2 结果与讨论

2.1 5种藻类与大型溞的化学计量比、N3不饱和脂肪酸含量关系

如图1所示,不同藻类和与之饲养的大型溞P:C(<0.05,2=0.7227),N:C(<0.05,2=0.8141)和N3不饱和脂肪酸含量(<0.05,2=0.9267)在双对数尺度上均呈显著的正相关关系,这说明大型溞取食的藻类决定了大型溞的P:C、N:C和N3不饱和脂肪酸含量.且藻类与大型溞的N3不饱和脂肪酸含量比P:C和N:C拟合度高,这说明藻类里的碳氮磷元素和N3不饱和脂肪酸通过食物链有效地传递给了大型溞,而其中N3不饱和脂肪酸比碳氮磷元素在能量流动和物质循环过程中传递效率更稳定.C、N、P是藻类和大型溞中重要的有机化合物组成元素,其中碳是构成生物原生质的基本元素,氮作为蛋白质、核酸和ATP的主要成份,磷作为核酸、ATP和生物膜主要组成元素,N3不饱和脂肪酸作为构成脂肪和磷脂的主要成分,其组成及分配是相互联系、不可分割的一个整体,它们的相互作用及与外界环境的关系共同决定着生物营养的水平和生长发育的过程,同时还决定了能量流动和物质循环的主要过程[39].例如植物的光合能力与叶片的氮含量密切相关,而氮素又依赖于光合作用提供能量给植物根系吸收运输氮素[40];凋落物的分解速率与其C:N比率呈负相关关系;土壤的C:N比率与有机质的分解、土壤呼吸等密切相关[41].藻类与大型溞之间的能量传递效率与C:P比呈负相关关系,即碳氮磷含量的分配会影响物质和能量在食物链中的传递效率[15].相比之下N3不饱和脂肪酸则以更稳定的形式通过食物链从第一营养级向第二营养级传递,其中,N3不饱和脂肪酸含量由低到高依次是蓝藻、隐藻、绿藻、硅藻、甲藻,藻类的N3不饱和脂肪酸含量直接影响大型溞的N3不饱和脂肪酸含量.Müller等[42]研究发现蓝藻的EPA含量远低于隐藻,Li等[36]研究也发现蓝藻的N3不饱和脂肪酸含量低于绿藻和硅藻,与本研究结果一致.

2.2 5种藻类饲育下大型溞对农药的抗性差异

将不同藻类饲育下的大型溞分别暴露在脂溶性农药(氰戊菊酯)和水溶性农药(吡虫啉)14d的死亡率做比较(图2),研究结果表明暴露在脂溶性农药中(图2a),抗性强度由强到弱依次为绿藻(LC50= 0.016μg/L)>硅藻(LC50=1.03×10-3μg/L)>隐藻(LC50= 3.02×10-5μg/L)>蓝藻(LC50=2.70×10-5μg/L)>甲藻(LC50=1.79×10-5μg/L);暴露在水溶性农药中,以硅藻为食的大型溞抗性最强,14d时LC50值为0.95mg/L, 以蓝藻为食的大型溞抗性最弱,14d时LC50值为1.27×10-3mg/L,其抗性强度由强到弱依次为硅藻(LC50=0.95mg/L)>绿藻(LC50=0.74mg/L)>甲藻(LC50=0.26mg/L)>隐藻(LC50=7.16×10-3mg/L)>蓝藻(LC50=1.27×10-3mg/L),以绿藻和硅藻为食的大型溞对农药的抗性显然比以甲藻、隐藻、蓝藻为食的大型溞强,在农药低浓度梯度,甲藻、隐藻、蓝藻饲育下的大型溞14d后的死亡率就已超过了80%.大型溞暴露在不同性质的农药中的抗性强度不同,对脂溶性农药的抗性差异比暴露在水溶性农药中更明显,即农药性质不同,以不同藻类为食的大型溞所表现的抗性强度也不同.

2.3 5种藻类饲育下大型溞对农药的抗性与其化学计量比、N3不饱和脂肪酸含量关系

如图3所示,不同藻类饲育下分别暴露在脂溶性和水溶性农药的大型溞14d时LC50值与其对应的大型溞P:C,N:C相关性不显著(>0.05),即大型溞对农药的抗性与其P:C和N:C不具有显著相关性;与化学计量比这些测量因子相比,大型溞虽然对脂溶性农药的抗性强度与其N3不饱和脂肪酸含量无显著相关性(>0.05),但是对水溶性农药的抗性强度与其N3不饱和脂肪酸成显著正相关关系(=2.536- 1.2289,<0.05),这说明N3不饱和脂肪酸含量是预测大型溞对水溶性农药抗性强度的最佳测量因子.

以不同藻类为食的大型溞对水溶性农药的抗性具有差异,而N3不饱和脂肪酸是影响关键因子.随着藻类的N3不饱和脂肪酸含量上升,通过食物链传递给大型溞的N3不饱和脂肪酸含量随之增加,N3不饱和脂肪酸不仅可以促进生物的生长发育与繁殖[42-44],还影响调节从免疫功能到神经发育的一系列关键过程[45-47],从而使大型溞对水溶性农药的抗性增强,这表明N3不饱和脂肪酸可能成为判定大型溞对水溶性农药抗性强度的依据.目前关于N3不饱和脂肪酸的研究多侧重于其对生物体生长繁殖的影响,例如Müller等[42]研究发现藻类N3不饱和脂肪酸含量的下降会抑制大型溞的生长与繁殖.Twining等[44]发现与陆生昆虫相比,雏鸟的成活率与富含N3不饱和脂肪酸的水生昆虫生物量显著正相关,是雏鸟发育过程的重要指标,N3不饱和脂肪酸也促进蟹类和鱼类的生长繁殖,改善其健康状况[48-49].

阴影部分表示实验变量与拟合回归线的误差

本研究从大型溞对农药的抗性变化中发现N3不饱和脂肪酸是其重要的影响机制因子而非化学计量比,N3不饱和脂肪酸作为细胞膜磷脂的主要组成部分,影响细胞膜的流动性和镶嵌在脂质双层中蛋白质的功能(包括受体、通道和酶类等)[50],N3不饱和脂肪酸通过增强细胞膜磷脂的水平从而增强抵抗环境水溶性农药进入细胞的能力,由于水溶性农药的抗性强度与其N3不饱和脂肪酸成显著正相关关系(图3f),这说明N3不饱和脂肪酸含量是预测大型溞对水溶性农药抗性强度的有效测量因子,且大型溞的N3不饱和脂肪酸含量越高,对水溶性农药的抗性越强.而另一方面,尽管在细胞膜的功能上具有重大作用,包含较多不饱和键的N3不饱和脂肪酸更容易受到自由基的攻击,从而影响细胞膜的结构和流动性以及细胞和组织的生理状态,具有自由基的脂溶性农药比水溶性农药更容易通过细胞膜进入细胞[51].脂溶性污染物的累积也会影响DHA和EPA的品质,进一步影响细胞膜受体的活性和生物体的脂类代谢[52],暴露在脂溶性农药的大型溞其N3不饱和脂肪酸含量与抗性不具有显著相关性,因此N3不饱和脂肪酸含量不能作为判断大型溞对脂溶性农药抗性强度的关键因子.

3 结论

3.1 作为食物的藻类与大型溞的P:C、N:C和N3不饱和脂肪酸含量成显著正相关关系,即藻类的碳氮磷元素和N3不饱和脂肪酸通过食物链有效地传递给了大型溞,其中N3不饱和脂肪酸比生源性元素在能量流动和物质循环过程中传递效率更稳定.

3.2 以不同藻类种群为食的大型溞暴露在同一农药中呈现不同程度的抗性,这说明藻类的质量会影响大型溞对农药的抗性强度.大型溞暴露在不同性质的农药中的抗性强度不同,对脂溶性农药的抗性差异比暴露在水溶性农药中更明显,即:农药性质不同,以不同藻类为食的大型溞所表现的抗性强度也不同.

3.3 藻类的N3不饱和脂肪酸含量越高,以其为食的大型溞N3不饱和脂肪酸越高,对水溶性农药的抗性越强.但暴露在脂溶性农药的大型溞其N3不饱和脂肪酸含量与抗性不具有显著相关性,大型溞对农药的抗性与其P:C和N:C也不具有显著相关性.因此,N3不饱和脂肪酸含量可作为判断大型溞对水溶性农药抗性强度的关键因子.

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Ecotoxicological effects and mechanism of algae on's resistance to pesticides.

HE Yan1, SHI Wan-qi1, PENG Xing-xing1, YANG Wei1, LI Zhe-xing1, WEN Xin1, LUO Jun-xiao1, LIU Hua-zu1, LI Wei1,2*

(1.College of Environment and Ecology, Chongqing University, Chongqing 400045, China；2.Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Rigon’s Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China)., 2022,42(9)：4416～4422

To explore the effects and mechanisms of algae on's resistance to pesticides, five algal species (Pyrrophyta, Bacillariophyta, Chlorophyta, Cryptophyta and Cyanophyta) were fed in equal amount to zooplankton, which was then exposed to two insecticides: imidacloprid (water-soluble) and esfenvalerate (fat-soluble). The median lethal concentration (LC50), stoichiometric ratio (P:C, N:C) and fatty acid content ofwere determined.The results show that, compared with biogenic chemical elements such as nitrogen and phosphorus, N3 unsaturated fatty acids can better reveal the predation ofon planktonic algae. The content of N3 unsaturated fatty acids in algae was a key factor affecting the resistance ofto water-soluble pesticides. The difference inresistance was more obvious to fat-soluble pesticides than to water-soluble pesticides. Therefore, the N3 unsaturated fatty acids is the best predictor of the resistance ofto water-soluble pesticides, and can be used to monitor the resistance and risk offood chain to pesticides in a natural environment.

algae；；esfenvalerate；imidacloprid；ecotoxicology；trophic cascade

X171.5

A

1000-6923(2022)09-4416-07

2022-02-14

国家自然科学基金资助项目(31700401)、广西重点研发计划(2018AB36010)

*责任作者, 副教授, liweieco@cqu.edu.cn

何 妍(1997-),女,贵州遵义人,重庆大学硕士研究生,主要研究方向为生态毒理学与水生态修复.