云南南涧地区致仔猪腹泻性大肠杆菌血清型鉴定与耐药性分析

尹忠文

（云南省大理洲南涧县公郎镇农业综合服务中心，云南大理 675701）

仔猪腹泻病是危害养猪业的主要疾病之一，临床中以细菌性腹泻最为常见，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、奇异变形杆菌等均可以引起仔猪的腹泻病，大肠杆菌是引起仔猪腹泻病最多且最为常见的细菌[1,2]。致病性大肠杆菌可以引起仔猪白痢、仔猪黄痢和仔猪水肿病，其感染和死亡率均较高，尤其是仔猪白痢、仔猪黄痢死亡率高达80%以上，严重影响着养猪业的发展[3]。国内相关研究表明大肠杆菌抗原结构复杂，具有多种致病血清型且无交互保护性，无有效疫苗保护，导致大肠杆菌病在不同的地区广泛发生与流行[4,5]。细菌生物被膜(Bacterial biofilm,BBF)是组成结构性细菌群落的主要物质，且在自然界中能形成生物被膜(Biofilm,BF)，研究表明，细菌的生物被膜形成能力与其毒力及耐药性有一定相关性[6,7]。仔猪的大肠杆菌病主要用抗生素进行治疗，而近年来，由于抗生素的滥用，致使细菌的耐药性较严重，且出现多重耐药菌株，加大了该病的治疗难度，同时耐药性和药物残留也威胁着人类健康[8]。

本试验采集患腹泻病仔猪的肛拭子、粪便、肝脏等病料243份进行大肠杆菌分离鉴定，对其流行病学进行检测，为云南南涧地区大肠杆菌病的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2018—2020年采集南涧县猪场的患腹泻病仔猪的肛拭子、粪便、肝脏等病料243份进行大肠杆菌分离鉴定。

1.2 试验材料

麦康凯培养基、96孔细菌培养板、大肠杆菌显色培养基、营养肉汤购自北京双旋微生物培养基制备科技公司；药物纸片购自杭州天和微生物制剂有限公司；细菌生化试纸条购自上海研晶生物科技有限公司；大肠杆菌O抗原鉴定因子购于中国食品药品监察所。

1.3 细菌的分离与培养

将患腹泻病仔猪的病料组织样品处理后，无菌条件下接种于麦康凯培养基上进行鉴别培养，37℃恒温培养18～24 h，挑取单个菌落接种于大肠杆菌显色培养基上37℃培养12～18 h，挑大肠杆菌显色培养基上的单个菌落接种于营养肉汤中，纯化培养后进行镜检和生化试验。

1.4 致病性试验

周倩[9]报道的方法，将分离的大肠杆菌菌株接种于LB培养基中进行纯化培养，挑取单个菌落放入LB液体培养基摇床37℃150 r/min振荡培养至浊度与0.5麦氏比浊管(1×108cfu)相同。用培养后的大肠杆菌菌液注射小鼠，按照0.2 mL/10 g菌液进行腹腔注射，对照组注射等量的无菌生理盐水，试验期7 d，试验期间观察小鼠的采食情况、精神状态、排泄情况、发病情况等，对死亡的小鼠进行解剖观察。

1.5 细菌血清型检测

索慧娜[10]报道，采用玻板凝集试验对分离的大肠杆菌菌株进行血清型检测，取制备的大肠杆菌单因子血清3 μL置于干净载玻片上，在取3 μL大肠杆菌高压悬液与血清混匀，30～60 s观察载玻片上液体是否发生反应。若出现明显凝集则为“阳性反应”，反之则为“阴性反应”。

1.6 细菌的生物被膜检测

对分离菌株进行被膜形成能力测定，判定标准以阴性对照孔OD值的2倍作为判断能否形成BF的临界点ODc，当OD≤ODc时，表示BF形成能力为零；当ODc＜OD≤2×ODc时，表示BF形成的能力较弱；当OD≥2×ODc时，表示生物被膜的形成能力较强。

1.7 药敏试验

参照美国生物被膜临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准药敏试验法进行操作和试验结果判断。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果

疑似大肠杆菌分离菌株在LB培养基、大肠杆菌显色培养基长出的菌落形态及与镜检形态学报道的大肠杆菌的培养特性和形态学基本一致。经统计采集的243份样品中分离到了113株符合大肠杆菌的培养特性和形态学。

2.2 细菌的生化试验结果

对分离的疑似大肠杆菌的菌株进行生化试验，结果表明，113株分离株鉴定为大肠杆菌，鉴定结果合格率为99.7%～99.9%。

2.3 致病性检测结果

攻毒组的小鼠在攻毒后的2～4 d出现发病，且个别小鼠出现急性死亡，剖检死亡的小鼠肠道有出血，肠黏膜出现脱落；肝脏、脾脏有不同程度的出血，且可分离得到的致病性大肠杆菌。对照组的小鼠健康存活。经统计分离出的113株大肠杆菌中，有87株大肠杆菌对小白鼠具有致病性。

2.4 血清型检测结果

由表1可知，用玻板凝集试验对分离的87株致病大肠杆菌进行血清学鉴定。分离出14种不同血清型的大肠杆菌，其中以O38(17.25%)、O101(18.4%)和O142(14.9%)为云南省大理州南涧县致仔猪腹泻病的主要流行血清型。

表1 血清型检测结果

2.5 被膜形成能力结果

分离的87株仔猪源致泻性大肠杆菌中，强形成被膜能力菌株有24株(27.6%)、中形成被膜能力菌株有34株(39.1%)、弱形成被膜能力菌株有17株(19.5%)、不形成被膜菌株有12株(13.8%)。

2.6 耐药性分析

由2可知，分离的87株仔猪致泻性大肠杆菌对阿莫西林、氨苄西林、多西环素、红霉素、磺胺间甲氧嘧啶、链霉素等6种药物的耐药率较高，耐药率在77.0%～98.9%之间；对庆大霉素、多粘菌素、新霉素、大观霉素等4种药物的耐药率在49.4%～65.5%之间；对氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素、头孢噻呋、头孢噻肟等6种药物的耐药率在9.2%～28.7%之间。

表2 药敏试验结果

3 讨论

国内外研究表明，致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻病的主要病原菌之一，其感染率和死亡率较高，对仔猪的危害较大，严重影响养猪业的发展。大肠杆菌为条件性致病菌，广泛存在于环境中，尤其是卫生条件较差的猪舍，当仔猪受到冷热等应激时，机体抵抗力下降，极易出现腹泻病，因此，注意环境卫生及环境的消毒是有效防控大肠杆菌病的重要措施之一[11,12]。关于仔猪腹泻性大肠杆菌的报道逐渐增多[13-17]，致病性大肠杆菌在我国各个地区广泛分布与流行，应该做好防控措施，减少该疾病的发生。本试验从云南南涧地区患腹泻病的仔猪病料中分离得到了87株致病性大肠杆菌，探明了大肠杆菌在该地区流行的血清型，说明大肠杆菌因感染宿主和区域的不同，菌株血清型也存在一定差异。发现云南南涧地区的大肠杆菌血清型，以O38(17.25%)、O101(18.4%)和O142(14.9%)为主要流行优势血清型。可以把O38、O101和O142作为研制大肠杆菌多价疫苗的候选菌株，为进一步研究防治该地区的仔猪腹泻性大肠杆菌疫苗奠定基础。此外，本试验发现分离的87株致病性大肠杆菌中以强、中形成被膜能力菌株较多。李金朋等[8]报道了从河南分离的猪源大肠杆菌具有生物被膜形成能力，张召兴等[10]报道了河北地区蛋鸡源大肠杆菌具有生物被膜形成能力，与本文报道基本一致。

此外，本试验对大肠杆菌的耐药性进行了分析，发现分离的87株致病性大肠杆菌对药物耐药率在49.4%以上的有10种药物，分别为阿莫西林、氨苄西林、多西环素、红霉素、磺胺间甲氧嘧啶、链霉素、庆大霉素、多粘菌素、新霉素、大观霉素。耐药率在9.2%～28.7%之间的有6中，分别为对氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素、头孢噻呋、头孢噻肟等。说明云南南涧地区流行的仔猪源致泻性大肠杆菌耐药性严重。

4 结论

本研究对2018—2020年采集的云南南涧地区不同养殖场中患腹泻病仔猪的肛拭子、粪便、肝脏等病料样品243份进行了大肠杆菌的培养鉴定，分离得到87株致病性大肠杆菌，以O38、O101和O142为主要流行优势血清型，以强、中、弱形成膜能力菌株为主，分离菌株对临床中10种药物的耐药率较高，且耐药性严重。为该地区大肠杆菌病的防治提供理论依据。